5 種不同純度藻藍蛋白的抗氧化特性

梅 邢，王 廣，田 瑞，劉 宇，夏蘭欣，田 成,3，李 偉,3，程 超,3,

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；3.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

自由基是生物體生命活動過程中由機體生物化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，這種中間產(chǎn)物在正常的生理情況下處于產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡狀態(tài)，但是當(dāng)生理狀態(tài)出現(xiàn)失衡時，自由基產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡就被打破，從而產(chǎn)生疾病[1]。藻藍蛋白是藻膽蛋白的一種，由脫輔基蛋白和藻膽素通過一個或兩個硫醚鍵共價連接而成[2]，廣泛存在于藍藻中。目前很多文獻一致認為藻藍蛋白具有抗氧化能力，如Romay等[3]首先報道了藻藍蛋白可以有效地清除羥基及烷氧自由基，并且評價了其作為體內(nèi)外抗氧化劑的潛力。但關(guān)于藻藍蛋白的抗氧化機理卻存在爭議，有人認為藻藍蛋白中發(fā)揮抗氧化作用的是其色基基團，如王庭健[4]發(fā)現(xiàn)基因重組別藻藍蛋白喪失了抗氧化活性，可能是由于在轉(zhuǎn)錄表達過程中丟失色基的緣故。此外，螺旋藻藻藍蛋白光照下能產(chǎn)生自由基，但在光照下通過提高pH值、添加十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脲及堿可使藻藍蛋白變性，導(dǎo)致其產(chǎn)生自由基能力消失，清除自由基能力明顯增強[5]，該研究同樣說明藻藍蛋白的色基部分對清除自由基能力貢獻較大。2009年Madhyastha等[6]將C-藻藍蛋白暴露在藍光下，發(fā)現(xiàn)其抗氧化作用增強，原因是C-藻藍蛋白的脫輔基蛋白α鏈出現(xiàn)了微小變化，β鏈的76～97位氨基酸發(fā)生了重排導(dǎo)致，由此可見脫輔基蛋白的變化也會直接影響藻藍蛋白的整體抗氧化特性；Rinalducci等[7-8]報道藻膽蛋白的蛋白質(zhì)部分降解后其產(chǎn)生自由基的能力增強，此結(jié)果說明蛋白降解后色基與蛋白比值增加會使藻膽蛋白的抗氧化能力消失，反而促進自由基的產(chǎn)生。Estrada等[9]發(fā)現(xiàn)冷凍、pH值升高或降低均會導(dǎo)致藻膽蛋白發(fā)色團周圍氨基酸殘基的電荷變化，同時也會影響藻膽色素與脫輔基蛋白以及色素與色素之間的相互作用，這些因素都會影響藻膽蛋白清除自由基的能力，這說明藻膽蛋白色基周圍的蛋白部分會影響其抗氧化能力。由此可見，蛋白和色基兩部分對藻膽蛋白的整體抗氧化的貢獻存在一定的爭議。鑒于此，本實驗以5 種不同色基和蛋白含量的藻藍蛋白為原料，選擇了3 種不同抗氧化機理的4 個抗氧化體系，即基于活性氧自由基的超氧陰離子自由基清除體系、基于氫原子轉(zhuǎn)移的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）體系、基于電子轉(zhuǎn)移的2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基體系和鐵離子總還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）體系，測定不同色基和蛋白質(zhì)量濃度的藻藍蛋白抗氧化能力，以期能更好地分析藻藍蛋白抗氧化基團。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藻藍蛋白A（來自螺旋藻）西安韻樂生物科技有限公司；藻藍素B（來自螺旋藻）東京化成工業(yè)株式會社；藻藍蛋白C（來自葛仙米）湖北民族大學(xué)食品科學(xué)與工程實驗室；藻藍蛋白E、F（來自螺旋藻）西安欣祿生物科技有限公司。ABTS、Trolox 東京化成工業(yè)株式會社；過硫酸鉀、乙醇、鄰苯三酚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、巰基乙醇、甘氨酸、溴酚藍、SDS（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鹽酸武漢市種田化工有限責(zé)任公司；三羥甲基氨基甲烷北京拓英坊科技有限公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺（均為分析純）北京拜爾迪生物有限公司；預(yù)染蛋白Marker 26616（10～180 kDa）加拿大Fermentas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104電子天平上海天平儀器廠；UV9000S紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司；F97Pro熒光分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司；U3000高效液相色譜儀美國賽默飛世爾科技公司；YY-6C型電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同藻藍蛋白的高效液相色譜分析

色譜柱：分子篩色譜柱（4.6 mm×300 mm，5 μm）；流動相：pH 7.0、0.5 mol/L磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀的緩沖液；流速為0.3 mL/min；檢測波長為620 nm。以藻藍素B為標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)分離圖譜確定其他4 種樣品的藻藍蛋白[10]。

1.3.2 不同藻藍蛋白的熒光光譜分析

配制質(zhì)量濃度2 mg/mL的藻藍蛋白A、B、E、F溶液以及質(zhì)量濃度5 mg/mL的藻藍蛋白C溶液，測定條件：掃描速率12 000 nm/min、激發(fā)波長500～700 nm、發(fā)射波長500～700 nm，進行熒光光譜掃描[11-12]。

1.3.3 不同藻藍蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

用樣品溶解液配制質(zhì)量濃度1 mg/mL的藻藍蛋白溶液，配制分離膠質(zhì)量分數(shù)為10%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為3%，標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker上樣量10 μL，5 種藻藍蛋白的上樣量15 μL，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），開始時電流為10 mA，待樣品進入分離膠后改為30 mA，當(dāng)染料前沿距硅膠框底邊1 cm左右時，停止電泳[13]。

1.3.4 不同藻藍蛋白的紫外-可見光譜分析

配制質(zhì)量濃度1 mg/mL的藻藍蛋白溶液，用紫外-可見分光光度計在200～800 nm波長處進行光譜掃描，用藻藍蛋白溶液在最大可見光波長處吸光度與蛋白質(zhì)特征波長處吸光度之比（Amax/A280nm）表示藻藍蛋白純度[14]。

1.3.5 FRAP法測定不同藻藍蛋白的總抗氧化能力

將300 mmol/L、pH 3.6的醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化鐵溶液以體積比10∶1∶1配制成FRAP工作液，分別取50、100、200、400、600、800 μmol/L和1 000 μmol/L Trolox溶液0.1 mL于試管中，加入2.9 mL FRAP工作液、37 ℃水浴10 min，于593 nm波長處測定吸光度，同時以0.1 mL蒸餾水加入2.9 mL FRAP工作液作空白對照[15-17]，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，A593nm為縱坐標(biāo)繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.000 9x-0.120 3，R2＝0.992 7。

藻藍蛋白溶液抗氧化能力的測定：用蒸餾水配制質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL和5.0 mg/mL藻藍蛋白溶液，取0.1 mL于試管中，加入2.9 mL FRAP工作液，37 ℃水浴10 min，在593 nm波長處測定吸光度，記錄吸光度。根據(jù)吸光度計算Trolox當(dāng)量，以每毫升所含Trolox的濃度表示FRAP，單位為μmol/mL。

1.3.6 不同藻藍蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力

取5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL過硫酸鉀溶液混合靜置過夜，得到ABTS工作液，將ABTS工作液用蒸餾水稀釋至734 nm波長處的吸光度為0.700±0.020（A0）。用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的藻藍蛋白A、B、E和F溶液，配制質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL和0.5 mg/mL的藻藍蛋白C溶液各5 mL，然后分別取1 mL的藻藍蛋白溶液，再加入4 mL的ABTS工作液，混合10 s后靜置6 min，在734 nm波長處測定吸光度，記錄吸光度Ai，用蒸餾水作為對照，記錄吸光度Aj[18-19]。按公式（1）測定ABTS陽離子自由基清除率。

1.3.7 不同藻藍蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力

用蒸餾水配制質(zhì)量濃度0.3、0.6、1.2、2.4 mg/mL和4.8 mg/mL藻藍蛋白溶液各5 mL，取25 ℃水浴保溫20 min的Tris-HCl（0.05 mol/L、pH 8.2）緩沖溶液3.7 mL，加入1 mL藻藍蛋白溶液，加入25 ℃水浴保溫20 min的15 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，搖勻，倒入比色皿中，立即于420 nm波長處讀取吸光度，每隔30 s測定一次吸光度，共測定4 min，重復(fù)3 次。以測定時間為橫坐標(biāo)，A420nm為縱坐標(biāo)繪制曲線，求其斜率vi，即為加入藻藍蛋白的鄰苯三酚的氧化速率。同時用蒸餾水代替藻藍蛋白溶液測定鄰苯三酚自氧化的速率v0[20-22]。按公式（2）測定超氧陰離子自由基清除率。

式中：v0為鄰苯三酚自氧化速率；vi為加入藻藍蛋白的鄰苯三酚氧化速率。

1.3.8 不同藻藍蛋白對氧自由基的吸收能力

用75 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）配制質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80 μg/mL和100 μg/mL的藻藍蛋白A、B、E、F溶液及質(zhì)量濃度分別為100、120、140、160、180 μg/mL和200 μg/mL的藻藍蛋白C溶液各10 mL，2.1 μmol/L熒光素鈉、100 mmol/L 2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）以及濃度為10、20、40、60、80、100 μmol/L的Trolox溶液。加入1 mL熒光素鈉及1 mL樣品溶液于試管中，37 ℃水浴保溫20 min，再加入1 mL 100 mmol/L AAPH，激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為535 nm，每1 min測定一次熒光強度，連續(xù)測定90 min。測定結(jié)束后計算熒光強度-時間曲線即熒光衰減曲線面積（AUCSample）[23-24]，另兩組中一組只加入熒光素鈉和磷酸緩沖液，測定其熒光衰減曲線面積（AUCFL），一組加入緩沖液和熒光素鈉及AAPH，測定其熒光衰減曲線面積（AUCAAPH），同時做Trolox標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)的對照實驗，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，以熒光熄滅曲線的延遲部分面積（netAUC）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為y＝1.297 5x+5.291 4，R2＝0.987 6。將藻藍蛋白所測的netAUC帶入Trolox回歸方程，計算藻藍蛋白的Trolox當(dāng)量，以每升所含Trolox的濃度表示ORAC，單位為μmol/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件分析，并進行新復(fù)極差差異顯著性分析和皮爾遜偏相關(guān)分析。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藻藍蛋白的高效液相色譜分析結(jié)果

圖 1 藻藍素B的高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatogram of phycocyanin B

以藻藍素B為標(biāo)準(zhǔn)樣品進行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖1～3，根據(jù)檢測波長620 nm處高效液相色譜峰對應(yīng)的紫外-可見掃描光譜圖確定該峰是否為藻藍蛋白分離峰。由圖1可知，藻藍素B主要分離峰保留時間為10.25 min，圖2中此峰對應(yīng)的紫外-可見掃描光譜顯示吸收峰分別位于280、357、620 nm，這與王肖肖等[25]研究報道的藻藍蛋白吸收峰非常吻合，因此可以將該樣品確定為藻藍蛋白，對比其他4 種樣品高效液相色譜圖（圖3）可以看出，樣品均為藻藍蛋白。

圖 2 藻藍素B高效液相色譜圖中保留時間為10.25 min分離峰的紫外-可見掃描光譜圖Fig. 2 Ultraviolet-visible spectrum of separation peak of at retention time of 10.25 min in high performance liquid chromatogram of phycocyanin B

圖 3 4 種藻藍蛋白的高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatograms of four different phycocyanins

2.2 不同藻藍蛋白的熒光光譜分析結(jié)果

圖 4 5 種藻藍蛋白的熒光發(fā)射光譜Fig. 4 Fluorescence emission spectra of five different phycocyanins

藻藍蛋白所有色基在功能上可分為兩種類型，其中一種是吸收能量并產(chǎn)生熒光的“熒光型”色基[26]。不同原料來源的藻藍蛋白最大熒光發(fā)射峰存在一定的差異，因此報道的熒光光譜也有一些區(qū)別[27]，但大部分藍藻中藻藍蛋白的最大熒光發(fā)射峰在635～650 nm之間[28]。實驗所用5 種藻藍蛋白的熒光發(fā)射光譜見圖4，5 種藻藍蛋白的最大發(fā)射波長均在650 nm左右，這與文獻[29]報道的結(jié)果吻合。

2.3 不同藻藍蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

圖 5 5 種藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig. 5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of five different phycocyanins

由圖5可知，A、B、E、F 4 種藻藍蛋白的目的條帶比較清晰，C樣品由于藻藍蛋白純度低，所以條帶略淡。SDS-PAGE圖中，比較清晰的條帶分子質(zhì)量為14.5 kDa左右，可能是藻藍蛋白的β亞基（圖中箭頭）；另外，有一條比較淡的條帶，分子質(zhì)量為16 kDa左右，可能是藻藍蛋白的α亞基（圖中箭頭），此結(jié)果與張成武等[30]的研究結(jié)果一致。

2.4 不同藻藍蛋白的紫外-可見掃描光譜分析結(jié)果

表1為不同純度藻藍蛋白色基及蛋白質(zhì)的特征吸收峰，藻藍蛋白的色基含量以可見光區(qū)最大吸收波長的吸光度表示，蛋白質(zhì)含量以280 nm波長處的吸光度表示。

由表1可知，5 種不同純度藻藍蛋白的蛋白質(zhì)含量由高到低依次為C、E、F、B、A；色基含量由高到低依次為E、A、F、B、C，純度由高到低依次為A、B、F、E、C。

不同藻藍蛋白紫外-可見掃描光譜如圖6所示。除藻藍蛋白C以外，其他4 種藻藍蛋白可見光區(qū)的吸收峰主要集中在610～620 nm，而樣品C除了620 nm波長處的吸收峰外，在560 nm左右波長處還有一個微弱的吸收峰，結(jié)合文獻[26]判斷藻藍蛋白C可能為R-藻藍蛋白，其他4 種為C-藻藍蛋白。

表 1 不同藻藍蛋白的色基、蛋白質(zhì)吸光度及純度結(jié)果Table 1 Chromophore contents, protein contents and purities of different phycocyanins

圖 6 5 種藻藍蛋白紫外-可見掃描光譜Fig. 6 Ultraviolet-visible spectra of five different phycocyanins

2.5 不同藻藍蛋白的抗氧化作用

目前用于評價物質(zhì)抗氧化能力的方法較多，如ABTS陽離子自由基清除體系、超氧陰離子自由基清除體系、ORAC體系等，楊繼濤[31]將這些抗氧化能力測定體系分為4 類：1）活性氧自由基清除體系，如羥自由基和超氧陰離子自由基體系；2）基于氫原子轉(zhuǎn)移體系，如ORAC、硫代巴比妥酸反應(yīng)物法、硫酸氰鐵法；3）基于電子轉(zhuǎn)移的抗氧化體系，包括1,1二苯基-2-三硝基苯肼、ABTS、FRAP、總酚估計法；4）金屬離子螯合能力體系。每一種抗氧化體系對評價物質(zhì)的抗氧化能力都各有優(yōu)缺點，基于此本實驗選擇了4 種抗氧化體系從3 個方面來比較不同色基含量的藻藍蛋白抗氧化能力。

2.5.1 不同藻藍蛋白在FRAP體系的總抗氧化能力

圖 7 5 種藻藍蛋白的FRAPFig. 7 FRAP of five different phycocyanins

由圖7可知，不同藻藍蛋白在FRAP體系中的總抗氧化能力存在明顯差異，在藻藍蛋白質(zhì)量濃度為0.5～5 mg/mL時，其總抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，計算比較FRAP為300 μmol/mL時對應(yīng)的藻藍蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FRAP體系中，5 種藻藍蛋白總抗氧化能力從大到小依次為A、B、E、F、C。

2.5.2 不同藻藍蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力

由圖8可知，藻藍蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)藻藍蛋白質(zhì)量濃度為0.1～1 mg/mL時，藻藍蛋白A、B、E、F與ABTS陽離子自由基清除能力呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；但藻藍蛋白C與ABTS陽離子自由基清除能力卻呈現(xiàn)對數(shù)關(guān)系，即隨著藻藍蛋白C質(zhì)量濃度的增加，對ABTS陽離子自由基的清除能力增加幅度越大。

圖 8 5 種藻藍蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig. 8 ABTS cation radical scavenging capacity of five different phycocyanins

2.5.3 不同藻藍蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力

圖 9 5 種藻藍蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力Fig. 9 Superoxide anion free radical scavenging capacity of five different phycocyanins

由圖9可知，藻藍蛋白對超氧陰離子自由基具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)藻藍蛋白質(zhì)量濃度為0.1～5 mg/mL時，藻藍蛋白E、F與超氧陰離子自由基清除能力呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；但藻藍蛋白A、C、B與超氧陰離子自由基清除能力卻呈現(xiàn)對數(shù)關(guān)系，且藻藍蛋白C的對數(shù)曲線斜率大于藻藍蛋白B和A，說明藻藍蛋白C對超氧陰離子自由基的清除速率大于藻藍蛋白B和A。

2.5.4 不同純度藻藍蛋白對氧自由基的吸收能力

圖 10 5 種藻藍蛋白對氧自由基的吸收能力Fig. 10 ORAC of five different phycocyanins

由圖10可知，當(dāng)藻藍蛋白質(zhì)量濃度為0～200 μg/mL時，5 種藻藍蛋白對氧自由基的吸收能力均呈對數(shù)關(guān)系。

按照圖8、9中擬合的回歸方程分別計算藻藍蛋白清除自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），根據(jù)圖7和圖10中擬合的回歸方程計算FRAP IC300μmol/mL和ORAC IC50μmol/L，結(jié)果見表2。

表 2 不同抗氧化體系IC50、IC300 μmol/mL及IC50 μmol/LTable 2 IC50, IC300 μmol/mL and IC50 μmol/L values of five different phycocyanins in different antioxidant systems

由表2可知，在FRAP體系中，5 種藻藍蛋白總抗氧化能力在0.01和0.05水平上均具有顯著差異，其中藻藍蛋白C的總抗氧化能力最好；在ABTS陽離子自由基體系中，藻藍蛋白A和B對ABTS陽離子自由基的清除能力差異不顯著，其他藻藍蛋白均有顯著差異；同樣地，藻藍蛋白C的IC50最小，說明其對ABTS陽離子自由基的清除能力最好；鄰苯三酚自氧化體系中，藻藍蛋白B和F的抗氧化效果差異不顯著，藻藍蛋白C對超氧陰離子自由基清除能力最好；在ORAC體系中，在0.01水平上藻藍蛋白E和F的效果相當(dāng)，差異不顯著，抗氧化能力最好的是藻藍蛋白A，藻藍蛋白C的抗氧化能力最差。

將表2中的數(shù)據(jù)與5 種藻藍蛋白的色基含量、蛋白質(zhì)量濃度和純度進行皮爾遜偏相關(guān)分析，結(jié)果見表3。

表 3 抗氧化指標(biāo)與藻藍蛋白純度、色基及蛋白質(zhì)量濃度的皮爾遜偏相關(guān)性分析Table 3 Correlational analysis of antioxidant properties with phycocyanin purity, chromophore content and protein content

由表3可知，在ABTS陽離子自由基體系中，藻藍蛋白清除ABTS陽離子自由基的IC50與色基含量呈極顯著正相關(guān)，與蛋白質(zhì)量濃度、藻藍蛋白純度呈極顯著負相關(guān)，即色基含量越高，IC50越大，對ABTS陽離子自由基清除能力越差，而藻藍蛋白中蛋白質(zhì)量濃度和純度越高，IC50越小，對ABTS陽離子自由基清除能力越好，說明蛋白質(zhì)部分對ABTS陽離子自由基的清除起主要作用；在超氧陰離子自由基體系中，藻藍蛋白中蛋白質(zhì)量濃度越高，IC50越小，對超氧陰離子自由基的清除效果越好，說明主要清除自由基的基團是蛋白質(zhì)部分；在ORAC體系中，色基含量越高和純度越大時，ORAC越小，其抗氧化效果越好，這說明色基部分對本體系的抗氧化效果起主要作用，這與Benedetti等[32]報道的藻藍蛋白中藻藍素可能是其清除體內(nèi)自由基的主要來源一致；在FRAP體系中，蛋白質(zhì)量濃度越高，F(xiàn)RAP越大，說明總抗氧化能力越強。

3 討 論

本實驗利用SDS-PAGE、熒光光譜和紫外-可見光譜對實驗所用的5 種藻藍蛋白進行了定性分析，同時選擇了3 種抗氧化機理體系對其抗氧化能力進行測定，如基于活性氧的超氧陰離子自由基清除體系、基于氫原子轉(zhuǎn)移的ORAC體系和基于電子轉(zhuǎn)移的ABTS陽離子自由基體系和FRAP體系，通過紫外-可見掃描光譜鑒定藻藍蛋白的純度、色基含量及蛋白質(zhì)量濃度與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析，從而對藻藍蛋白抗氧化機理提出猜想。實驗結(jié)果表明，在基于活性氧和電子轉(zhuǎn)移的抗氧化體系中，藻藍蛋白起主要抗氧化作用的基團是蛋白質(zhì)部分，在基于氫原子轉(zhuǎn)移的體系中，藻藍蛋白起主要作用的是色基基團。在ORAC法中，以AAPH作為自由基為來源，抗氧化劑通過提供氫離子而形成更為穩(wěn)定的自由基，從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，藻藍蛋白的發(fā)色團（藻藍素）中開放的四吡咯鏈與膽紅素的結(jié)構(gòu)非常相似，而Stocker等[33]研究發(fā)現(xiàn)，膽紅素具有消除過氧化物自由基的作用，其機理是膽紅素可將過氧化物自由基綁定到C10位四吡咯分子的一個氫原子上，使自由基與中心碳原子形成共振穩(wěn)定，最終擴展到整個膽紅素，藻藍蛋白色基實現(xiàn)抗氧化作用的機制可能與其類似；ABTS法和FRAP法則是基于電子轉(zhuǎn)移的一種方法，Evstigneev[34]發(fā)現(xiàn)藻膽蛋白具有電子轉(zhuǎn)移的功能，在用藻膽蛋白或藻膽體所構(gòu)成的電化學(xué)池中，光照后獲得了一定的光生電勢，表明當(dāng)存在合適的電子受體時，藻膽蛋白就能夠給出電子，在這兩個體系中，藻藍蛋白的抗氧化作用與蛋白質(zhì)部分呈正相關(guān)。鄰苯三酚自氧化法則是由于藻藍蛋白能催化超氧陰離子與H+結(jié)合生成O2和H2O2，通過阻止中間產(chǎn)物的積累從而達到對超氧陰離子的清除作用。綜上，藻藍蛋白在不同的體系中表現(xiàn)出不同的抗氧化機理，這主要是因為在不同體系中藻藍蛋白發(fā)揮抗氧化作用的主要基團不同，這也是藻藍蛋白的抗氧化作用存在差異的主要原因。