C7-位白楊素衍生物的生物活性研究

李紅俠，吳長昊，王 晴，王 靜

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

白楊素，又叫白楊黃素，是一種黃酮類化合物，化學(xué)名為5,7-二羥黃酮. 白楊素具有廣泛的生物活性，如抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗焦慮[3]、抗菌[4]、抗腫瘤[5]等. 其中抗腫瘤活性引起了科研人員的關(guān)注[6-9]. 到目前為止癌癥是最難以攻克的疑難雜癥之一，在世界范圍內(nèi)每年有800萬人死于癌癥,且每年死于癌癥的人數(shù)仍在增加. 對于抗癌藥物的研究很自然就成為了藥物研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn). 白楊素能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系、胃癌以及乳腺癌等癌細(xì)胞的增殖效果[10]. 研究表明，它主要通過拮抗雌激素受體，抑制MCF-7細(xì)胞的DNA合成. 天然的白楊素脂溶性和水溶性都較差，表現(xiàn)為胃腸道對其的吸收降低，而且5、7位的羥基容易在體內(nèi)被糖基化，從而導(dǎo)致代謝活性降低，限制了臨床的應(yīng)用[11]. 為了彌補(bǔ)這些不足，目前科研工作者用白楊素作為主要原材料，通過改變白楊素衍生物的結(jié)構(gòu)來獲得生物利用度可觀的、選擇性好的、沒有毒副作用的白楊素化合物. 目前對白楊素母體的改造，主要是在白楊素的 4、5 和 7 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，一般通過藥效團(tuán)拼合、親水性胺基側(cè)鏈、酯化、金屬配合物和生物電子等排等，形成小分子的定向化學(xué)修飾，得到白楊素的衍生物，并對其生物活性進(jìn)行研究[12-15]. 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,影響藥物吸收的一個重要因素是膜通透性,它與脂溶性有關(guān). 藥物脂溶性的高低與細(xì)胞吸收的效率成正比. 哌嗪具有抗腫瘤譜廣、毒性低(LD50mg/kg)、易溶于水等優(yōu)點(diǎn)[16-17]. 為了增加藥物的脂溶性,將哌嗪引入到白楊素中[18],對白楊素的C7位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得白楊素衍生物，以期獲得細(xì)胞吸收較好的抗癌先導(dǎo)物.

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：HeLa細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞，A549細(xì)胞，293T(上海通派生物科技有限公司).

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：倒置熒光顯微鏡(Olympus IX71,日本Olympus)； Heracel CO2培養(yǎng)箱(美國Kendro)，流式細(xì)胞儀(BD)； 掃描酶標(biāo)儀(Sunrise，奧地利TECAN).

主要試劑：C7-白楊素衍生物(本院藥物實(shí)驗(yàn)室合成)； 新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 溴化四甲基偶氮唑藍(lán)(阿拉丁)； DMEM培養(yǎng)基、雙抗(南京化學(xué)試劑有限公司)； Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(北京索萊寶). 其他試劑均為分析純，均購于上海國藥集團(tuán).

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用的細(xì)胞株是人源胚胎腎上皮細(xì)胞，即293T. 取剛長至完整單層的一瓶細(xì)胞，胰蛋白酶消化，吹打均勻. 再將生長至對數(shù)期的293T細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞稀釋至大約105個/毫升. 200微升/孔，置于培養(yǎng)箱(5%的二氧化碳，溫度37 ℃)中培養(yǎng). 正常組、陽性對照組和藥物組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加藥，每組重復(fù)處理3次.

加藥24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 15 μL，搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h. 吸出培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜150 μL，于搖床搖動8～10 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解. 于酶標(biāo)儀(波長490 nm)檢測各孔的吸光值(OD)，根據(jù)吸光值計(jì)算CC50值.

1.3.2 抗增殖活性測試

在培養(yǎng)好的單層細(xì)胞中加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，用槍小心吹打，收集細(xì)胞. 取兩滴細(xì)胞懸液經(jīng)臺盼藍(lán)(Trypan Blue)染色后置于倒置顯微鏡下，計(jì)下活細(xì)胞數(shù)目(死的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)小于或等于5%). 將細(xì)胞數(shù)目調(diào)至1×105個/毫升細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)中，200微升/孔，置于培養(yǎng)箱(5%的二氧化碳，溫度37 ℃)中培養(yǎng)12 h之后取出培養(yǎng)板，取出培養(yǎng)板后于每孔中加100μL含不同濃度被測樣品的溶液，使得藥物最終濃度分別為0、10、50、100、150 μM/L. 對照組不加藥品，重復(fù)3次. 加完藥后于搖床上輕輕混勻，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 取出培養(yǎng)板，每孔加入二甲亞砜150 μL，于搖床均勻晃動10 min左右，用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度值. 根據(jù)各孔的吸光度值，算出藥物對細(xì)胞增殖的IC50值.

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至生長對數(shù)期，調(diào)細(xì)胞濃度，以105個/毫升細(xì)胞濃度，將HeLa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液2 mL，12 h后加藥，最終濃度分別為0、10、15、20 μM/L. 對照組加細(xì)胞培養(yǎng)基2 mL. 培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞處理，胰酶消化，3500 r/min離心5 min后棄去上清，用冷的PBS洗滌兩次后，加Binding Buffer 300 μL 輕輕混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC/PI和5 μL PI，輕輕混勻，再加入200 μL Binding Buffer混勻，室溫避光反應(yīng)10～15 min，于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，每組樣品收集細(xì)胞1萬個. 使用 FlowJo 7.6.1(FACSCA2BUR, Becton Dickinson，USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及出圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對293T的毒性分析

通過MTT法測試該化合物對人腎上皮細(xì)胞293T的毒性，結(jié)果藥物對人腎上腺上皮細(xì)胞株-293T細(xì)胞的CC50值為(113.56±0.43)μM/L，陽性對照藥厄洛替尼的CC50值為(89.52±0.43)μM/L，說明該藥物的毒性很低，處于毒性安全區(qū).

2.2 藥物對腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性

由表1可知，白楊素C7位結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾后，對3種腫瘤細(xì)胞的抗增殖性明顯高于白楊素本身，尤其對HeLa細(xì)胞的效果較好，IC50值為(20.62±0.35)μmol/L. 但與對照藥厄洛替尼相比，沒有對照藥的效果好.

表1 白楊素衍生物對HeLa、MCF-7、A549細(xì)胞的抗增殖活性(IC50， μmol/L)

2.3 藥物對細(xì)胞凋亡的結(jié)果分析

為了檢測藥物對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，選用抑制增殖效果最好的宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，設(shè)置了不同藥物濃度梯度的流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示. 當(dāng)藥物濃度分別為10、15、20 μM/L時，細(xì)胞凋亡率分別為11.02%、14.39%、22.32%，沒經(jīng)藥物處理的對照的細(xì)胞凋亡率為1.39%. 可以看出，隨藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也增加，與藥物濃度呈劑量依賴性.

3 討論

本研究的藥物是在白楊素的7-位羥基上進(jìn)行修飾，將得到的藥物進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞的一系列實(shí)驗(yàn). 根據(jù)對HeLa、MCF-7、A549細(xì)胞的體外測試結(jié)果，藥物的生物活性(抗腫瘤細(xì)胞)明顯增強(qiáng)，尤其對HeLa細(xì)胞，IC50值為20.62 μmol/L； 在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，引起細(xì)胞凋亡率與藥物劑量呈依賴關(guān)系. 這些結(jié)果為今后進(jìn)一步研究白楊素衍生物的其他生物活性提供一定的參考依據(jù).

圖1 藥物對HeLa細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡