基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌小鼠血清代謝組學(xué)分析

徐婷婷，熊玥，張婷，嚴(yán)士海，吳堅(jiān)，劉沈林，劉史佳，張其德

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心，江蘇 南京 210036)

胃癌是全球第五大常見的癌癥，其發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤前列[1]。據(jù)估計(jì)，全球每年有約超100萬的新發(fā)病例，我國占40%，隨著新的治療手段的不斷發(fā)現(xiàn)，在全球范圍看其發(fā)病率和死亡率整體有下降趨勢，但我國依舊處于較高水平[2]。目前，胃癌早期的治療手段主要為內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)和內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)(ESD)。進(jìn)展期胃癌多以胃癌根治術(shù)為主，輔以靶向治療、化療、免疫治療和支持治療等[2-3]。以上現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段雖能在一定程度上提高患者存活率，但在治療過程中患者正氣受損，進(jìn)而影響了患者的生存質(zhì)量，縮短了其生存期[4]。而中醫(yī)藥因其不良反應(yīng)小、可減輕化療不良反應(yīng)的優(yōu)勢，在胃癌綜合治療、緩解癥狀、提高生命質(zhì)量等中發(fā)揮了重要的作用，受到了人們越來越多的重視[5]。

中醫(yī)認(rèn)為脾虛正衰是晚期胃癌的病機(jī)關(guān)鍵，癌毒彌留為晚期胃癌的重要致死因素。全國名中醫(yī)劉沈林教授臨床治療上強(qiáng)調(diào)應(yīng)以宏觀辨證與微觀辨病相結(jié)合，一則健脾養(yǎng)正，滋養(yǎng)后天；一則化瘀消癥，攻邪除結(jié)。晚期胃癌的治療關(guān)鍵在于扶正健脾以調(diào)節(jié)氣血陰陽，設(shè)立經(jīng)驗(yàn)方健脾養(yǎng)正消癥湯，方中黃芪、黨參、炒白術(shù)、茯苓、山藥、薏苡仁、炙甘草益氣健脾，淡滲利濕，補(bǔ)益中焦以恢復(fù)其運(yùn)化受納之功；氣虛之證常兼氣滯，謂之“虛氣留滯”，用陳皮、木香行氣化滯，斡旋氣機(jī)，以助運(yùn)化；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝，和營消瘀；菝葜、石打穿解毒抗癌，消癥化積。諸藥合用以補(bǔ)益中氣，滲濕泄?jié)?，行氣化滯，和營養(yǎng)血，抗癌解毒，以復(fù)脾胃受納與健運(yùn)之職，共奏健脾益氣、解毒消癥之功。臨床使用可顯著改善胃癌患者的臨床癥狀和檢測指標(biāo)，療效確切。通過現(xiàn)有的基礎(chǔ)試驗(yàn)結(jié)果，健脾養(yǎng)正消癥方能夠抑制移瘤的生長及提高免疫狀態(tài)[6]。

代謝組學(xué)是考察生物體在受到外界病理生理刺激或擾動(dòng)后生物體內(nèi)所有代謝物質(zhì)變化的科學(xué)[7]，是當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)領(lǐng)域，在揭示生物體代謝活動(dòng)、疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷治療、藥物發(fā)現(xiàn)、藥效作用機(jī)制等方面發(fā)揮了越來越重要的作用。綜上所述，為研究健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的療效相關(guān)特征分子，本實(shí)驗(yàn)以裸鼠皮下移植瘤為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，檢測給予健脾養(yǎng)正消癥方前后SGC-7901裸鼠的血清代謝物變化規(guī)律，進(jìn)而探討健脾養(yǎng)正消癥方在調(diào)控胃癌內(nèi)源性機(jī)制方面的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動(dòng)物

人胃癌SGC-7901細(xì)胞(由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；SPF級BALB/c-nu裸鼠36只，均為雄性，4周齡，體質(zhì)量(16.6±0.92)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(京)2012-0001。在12 h光照/黑暗循環(huán)下將小鼠圈養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)溫度(20±2)℃和濕度(50%±10%)條件下。在開始實(shí)驗(yàn)之前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)至少7 d。實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

健脾養(yǎng)正消癥方，低劑量組(方藥組成：黃芪30 g，黨參15 g，炒白術(shù)10 g，茯苓10 g，山藥15 g，薏苡仁20 g，陳皮6 g，木香10 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，菝葜30 g，石見穿30 g，炙甘草3 g)，高劑量組(重用黃芪60 g，黨參30 g，余同低劑量組)。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)朱玉鳳教授鑒定，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供中藥煎劑，10倍蒸餾水加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取的藥液，水浴濃縮，滅菌備用。小牛血清(杭州四季青公司，批號：20150511)；RPMI-1640培養(yǎng)基(南京凱基生物有限公司，批號：150812)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；甲醇、乙腈(美國TEDIA公司，色譜純)；氯代苯丙氨酸溶液(上海源葉生物科技有限公司)；甲酸(德國Fisher公司，色譜純)。

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；島津LC-30AD液相色譜儀(日本島津公司)；AB Sciex Triple TOF 5600質(zhì)譜檢測器(美國AB公司)；Thermo 5430R離心機(jī)；Sorvall Legend Micro 17微量離心機(jī)；渦旋儀(金壇西城新瑞儀器廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將第6代人胃癌SGC-7901細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞生長呈70%～80%融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108mL-1，每只裸鼠右側(cè)腋下接種0.2 mL的細(xì)胞懸液，待所有的瘤組織長至大約50～100 mm3時(shí)，造模成功，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 動(dòng)物分組及給藥 將36只裸鼠隨機(jī)分為模型組(Model)，健脾養(yǎng)正消癥方高(LDMEH)、低劑量組(LDMEL)，每組12只。模型組予以生理鹽水灌胃，0.2 mL/次，2次/d，5次/周，連續(xù)3周。健脾養(yǎng)正消癥方高、低劑量組分別以健脾養(yǎng)正消癥方74.30、37.15 g/kg灌胃，0.2 mL/次，2次/d，5次/周，連續(xù)3周。灌藥結(jié)束后次日處死荷瘤裸鼠，剖瘤稱質(zhì)量。末次給藥24 h后對所有小鼠進(jìn)行眼球取血，取約0.5～1 mL于血清管中，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心10 min取上清后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中凍存待測。

2.2.3 抗腫瘤效果觀察 以荷瘤裸鼠體質(zhì)量的變化來反映健脾養(yǎng)正消癥方對治療狀態(tài)的影響，體質(zhì)量每5 d測定1次，直至末次給藥治療后。以瘤質(zhì)量抑制率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%,來評估健脾養(yǎng)正消癥方的抗腫瘤效果。

2.3 樣品前處理

取血清樣品各45 μL，離心10 s后，加入3倍量乙腈沉淀蛋白，渦旋30 s后，4 ℃靜置過夜。于4 ℃以13 000 r/min離心10 min，取上清并揮干，再用100 μL 50%乙腈溶液復(fù)溶，4 ℃離心后取90 μL于進(jìn)樣小瓶中待測。同時(shí)將各組血清樣品合并作為質(zhì)量控制(Quality control,QC)樣品，以相同方法處理。每隔8個(gè)樣品分析QC樣品，以檢驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性。

2.4 色譜分析方法

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，梯度洗脫采用流動(dòng)相A(1‰甲酸水)和流動(dòng)相B(1‰甲酸乙腈)。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；柱溫：40 ℃；洗脫梯度程序：0.5 min，3%B；0.5～1.5 min，20%B；1.5～4 min，65%B；4～11 min，95%B；11～15 min，95%B；15～15.4 min，3%B；15.4～20 min，3%B。

2.5 質(zhì)譜方法

使用AB SCIEX Triple TOF 5600，采用ESI離子源，質(zhì)譜參數(shù)為：MS質(zhì)量范圍m/z60～1 000；源溫度550 ℃；霧化氣壓力50 psi(1 psi=6.8948 Pa)；輔助氣壓力50 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子掃描電壓5 500 V(正離子模式)；MS2質(zhì)量范圍m/z40～1 000。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

獲取UPLC-Q-TOF/MS圖譜后，采用Analyst?TF 1.7導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，使用Markview軟件進(jìn)行峰對齊。原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入One-MAP代謝云平臺獲取最終的峰表。將峰表導(dǎo)入MetNormalizer R包中進(jìn)行QC數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化[8]，校正后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-14.1軟件(14.1 Version，Umertrica AB, Sweden)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。通過OPLS-DA的VIP>1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)來篩選前后變化顯著的差異代謝物，采用大連達(dá)碩開發(fā)的代謝組學(xué)小分子化合物快速鑒定分析軟件系統(tǒng)OSI/SMMS2.0將代謝物在HMDB(Human Metabolome Databatabase)、METLIN和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫中檢索與確認(rèn)，得到最終匹配內(nèi)源性代謝物。已鑒定的內(nèi)源性差異代謝物利用MetaboAnalyst 5.0軟件進(jìn)行相關(guān)代謝通路分析。

3 結(jié)果

3.1 健脾養(yǎng)正消癥方對SGC-7901細(xì)胞裸鼠抗腫瘤效果

結(jié)果表1～2。

表1 不同組別裸鼠各階段體質(zhì)量比較

表2 各組裸鼠皮下移植瘤瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

3.2 總離子流圖(Total ion chromatogram，TIC)

采用UPLC/Q-TOF-MS方法檢測獲得正負(fù)離子TIC圖(圖1)。從TIC圖中可以直觀地發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清和健脾養(yǎng)正消癥方高、低劑量組小鼠中存在一些差異。經(jīng)過80%去零規(guī)則消除缺失值，一共提取出了539個(gè)正離子，258個(gè)負(fù)離子。同時(shí)獲取到相應(yīng)的色譜峰高及峰面積。

注：正離子模式下,A.模型組;B.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組;C.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組；負(fù)離子模式下,D.模型組;E.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組;F.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組

3.3 多變量統(tǒng)計(jì)分析

采用PCA模型觀察模型組、健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組和低劑量組之間的總體分布趨勢，以及給予健脾養(yǎng)正消癥方后的裸鼠血清代謝物整體變化情況。正離子模式下PCA分析得到一個(gè)含3個(gè)主成分的模型R2X為0.614，Q2為0.482。負(fù)離子模式下PCA分析得到一個(gè)含4個(gè)主成分的模型R2X為0.417，Q2為0.764，說明本次PCA模型的解釋性和預(yù)測性都較好。圖2可見正負(fù)離子模式下3組血清樣本在空間上的分布情況，結(jié)果顯示3組血清樣本在正負(fù)離子模式下都能夠明顯區(qū)分。健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組與模型組產(chǎn)生明顯區(qū)分，并向高劑量組方向偏移，說明健脾養(yǎng)正消癥方影響了SGC-7901細(xì)胞裸鼠血清中的代謝物，對其體內(nèi)的代謝起到一定的調(diào)節(jié)作用。

注：A.正離子模式的PCA得分圖;B.負(fù)離子模式下PCA得分圖

采用OPLS-DA分析方法去除與分組無關(guān)的信息后，對血清全譜進(jìn)行模式判別分析，來突出組間差異，尋找潛在的差異代謝物。如圖3～4所示，在正負(fù)離子模式下，兩兩對比樣本能夠顯著分離，利用置換檢驗(yàn)(Permutation test)對各OPLS-DA模型進(jìn)行重復(fù)性和可靠性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示:模型有效，具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。

注：A.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組與模型組對比的OPLS-DA得分圖；B.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組與模型組對比的OPLS-DA得分圖；C.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組與模型組對比的置換檢驗(yàn)圖；D.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組與模型組對比的置換檢驗(yàn)圖

注：A.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組與模型組對比的OPLS-DA得分圖；B.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組與模型組對比的OPLS-DA得分圖；C.健脾養(yǎng)正消癥方低劑量組與模型組對比的置換檢驗(yàn)圖；D.健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組與模型組對比的置換檢驗(yàn)圖

3.4 差異代謝物篩選與鑒定

為進(jìn)一步確定給藥后裸鼠血清內(nèi)源性代謝物的差異，采用OPLS-DA模型中的變量投影重要度(VIP)值，VIP>1和t檢驗(yàn)中P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)來篩選潛在的差異代謝物。倍數(shù)變化(Fold change,FC)來反映健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組、低劑量組和模型組相比較血清代謝物峰面積的比值，F(xiàn)C>1表明健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組或低劑量組裸鼠血清中該代謝物含量上升，F(xiàn)C<1表明健脾養(yǎng)正消癥方高劑量組或低劑量組裸鼠血清中該代謝物含量下降。采用大連達(dá)碩OSI/SMMS2.0數(shù)據(jù)庫以及KEGG、HMDB以及METLIN等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索對篩選出的差異代謝物進(jìn)行鑒定，共鑒定了67種代謝物。LDMELvsModel和LDMEHvsModel符合標(biāo)準(zhǔn)的各有10個(gè)內(nèi)源性差異代謝物，重疊的內(nèi)源性差異代謝物有5種，包括正離子模式下(ESI+)2個(gè)，負(fù)離子模式下(ESI-)3個(gè)，如表3所示。

表3 低劑量組和模型組比較、高劑量組和模型組比較的差異代謝物

3.5 代謝通路分析

為了尋找健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的相關(guān)代謝通路，將5個(gè)差異代謝物輸入MetaboAnalyst 5.0在線網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析，依次查看各差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫中所對應(yīng)的作用靶點(diǎn)，如表4所示，代謝通路主要涉及α-亞麻酸和亞油酸代謝、果糖和甘露糖的降解、半乳糖代謝以及花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)代謝。如圖5所示，與差異代謝物相關(guān)性較強(qiáng)的是由花生四烯酸激活的α-亞麻酸、亞油酸(Linoleic acid，LA)代謝和花生四烯酸代謝通路。

表4 代謝通路分析

注：a.花生四烯酸代謝；b.α-亞麻酸和亞油酸代謝；c.果糖和甘露糖的降解；d.半乳糖代謝

4 討論

健脾養(yǎng)正消癥方是劉沈林教授針對胃癌本虛標(biāo)實(shí)，即正氣不足為本，瘀毒內(nèi)結(jié)為標(biāo)的基本病機(jī)創(chuàng)立的[6]。長期的臨床經(jīng)驗(yàn)證明此方對于胃癌具有良好的治療效果，聯(lián)合化療可以提高化療抑制胃癌轉(zhuǎn)移的效果，改善患者細(xì)胞免疫功能，提高患者治療期間生活質(zhì)量，延長患者生存期[9-10]。本研究通過建立人胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠模型，采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法探索該方治療小鼠胃癌前后血清代謝物的變化以及代謝途徑，發(fā)現(xiàn)治療前后小鼠的血清代謝物水平顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，給予健脾養(yǎng)正消癥方低劑量和高劑量組的胃癌小鼠體內(nèi)花生四烯酸含量逐漸上調(diào)，并呈劑量依賴性，進(jìn)而觸發(fā)了α-亞麻酸、亞油酸代謝和花生四烯酸代謝通路。

AA是一種人體內(nèi)含量較多，分布最廣的人體非必需多元不飽和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于細(xì)胞膜上，并在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理病理作用[11]。眾所周知的是AA在炎癥和病理?xiàng)l件下，會(huì)釋放為游離AA并通過環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)途徑生成前列腺素(Prostaglandins，PGs)和血栓素(Thromboxanes，TXs)；脂氧合酶(Lipoxygenases，LOXs)途徑生成白三烯(Leukotrienes，LTs)，脂氧素(Lipoxins，LXs)和羥基二十碳四烯酸(Hydroxyeicosatetraenoic acids,HETEs)；通過細(xì)胞色素P-450酶途徑生成環(huán)氧二十碳四烯酸(Epoxyeicosa enoic acids,EETs)等一系列AA代謝產(chǎn)物，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)等機(jī)體的生理活動(dòng)[12]。

AA在體內(nèi)主要由亞油酸(LA)轉(zhuǎn)化合成，但在LA缺乏，無法合成人體所需AA。目前，多個(gè)國家批準(zhǔn)AA作為營養(yǎng)添加劑使用，現(xiàn)市場上多種保健品和嬰幼兒奶粉中已添加AA[13]。其次，有研究表明AA在促進(jìn)骨骼肌組織的修復(fù)與生長、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)健康、改善阿爾茲海默癥早期癥狀減緩疾病進(jìn)展、增強(qiáng)免疫力等方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。并且，在正常代謝情況下，AA的增加不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，不僅如此，還有研究表明AA與促炎癥的IL-6和IL-1水平呈負(fù)相關(guān)，與抗炎腫瘤壞死因子-β水平呈正相關(guān)，這說明當(dāng)AA水平升高時(shí)可產(chǎn)生抗炎和抗腫瘤效果[16]。同時(shí)，AA代謝產(chǎn)物前列腺素(Prostaglandins,PGs)可以促進(jìn)免疫細(xì)胞吞噬作用，前列腺素E(Prostaglandin E,PGEs)類物質(zhì)通過對白細(xì)胞具有輕度吸引作用，促進(jìn)白細(xì)胞游走，加強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化反應(yīng)來增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)制[17-18]。研究顯示AA通過體內(nèi)三大代謝途徑，產(chǎn)生的前列環(huán)素(Prostacyclin,PGI)合成酶、PGI2和PGI受體IP，LXs和LXR，脂肪特異性磷脂酶A2(Adipose-specific PLA2,AdPLA)以及幾種分泌型磷脂酶A2(Secreted phospholipase A2,sPLA2s)亞型都表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而前列腺素D2(Prostaglandin D2,PGD2)通過激活2種不同的受體發(fā)揮其功能，也表現(xiàn)出抗腫瘤特性[19]。

綜上所述，AA在損傷相關(guān)的炎癥和許多疾病狀態(tài)中發(fā)揮著核心作用，它在體內(nèi)的代謝方式?jīng)Q定了它的促炎或抗炎活性。我們研究發(fā)現(xiàn)，給予健脾養(yǎng)正消癥方小鼠的血清中，AA的水平發(fā)生顯著提高，但并未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)代謝產(chǎn)物的水平發(fā)生顯著變化。因此健脾養(yǎng)正消癥方可能通過提高AA的體內(nèi)水平，促進(jìn)了免疫細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)了機(jī)體免疫力，又或者通過上述AA代謝過程中產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的代謝產(chǎn)物，來抑制腫瘤的生長，涉及的具體機(jī)制還需等待進(jìn)一步的研究探索。