刺山柑對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠Th17/Treg 免疫失衡的影響?

霍新慧，徐海燕，樊思恩，赫吉銘，黨 歡

新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊830054

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）主要表現(xiàn)為進行性、慢性、對稱性多關(guān)節(jié)炎，RA 不僅直接導致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，還可累及全身多個器官，嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量［1］。RA 的病因至今尚未明確，一致認為感染和自身免疫紊亂是其發(fā)生的關(guān)鍵因素［2］，在免疫機制方面主要與T細胞亞群數(shù)量和功能密切相關(guān)［3］。

刺山柑（Capparis Spinosa）又名槌果藤，野西瓜、老鼠瓜，新疆民間用該藥外敷治療RA 歷史悠久［4］。本實驗在建立佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的基礎(chǔ)上通過檢測大鼠血清白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、IL-6、IL-10、IL-23及轉(zhuǎn)化生長因子β(tranforming growth factor-β，TGF-β)含量，探討新疆特色藥材刺山柑對類風濕性關(guān)節(jié)炎可能的免疫調(diào)節(jié)機制，為臨床應(yīng)用刺山柑治療RA提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級Wistar 大鼠40 只，體質(zhì)量（180±20）g，雌雄各半，購于新疆醫(yī)科大學動物中心，實驗動物合格證號：SYXK（新）2016-0002，動物標準住宿條件為溫度（22±2）℃，濕度55%～60%，明暗交替各12 h，自由飲食、攝水，屏障環(huán)境質(zhì)量合格證：65000700000749。

1.2 主要藥物與試劑刺山柑（新疆新特藥有限公司，新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院中藥系藥物資源教研室鑒定）；甲氨蝶呤片（上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥廠，批號：161003，規(guī)格2.5 mg/片）；完全弗氏佐劑（Sigma公司，批號：F5506）；IL-17、IL-6、IL-10、IL-23及TGF-βELISA檢測試劑盒（美國Bim公司，批號：B164775、5SNCCTLQCA、MJPMS5HZNT、JHNHCJX3UZ、3RULJ3FEUH）。

1.3 模型制備左后足跖底部皮膚常規(guī)消毒，拉直后肢，用1 mL注射器皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑（每只0.1 mL）。造模3 天后評定模型成功與否：無關(guān)節(jié)紅腫計0 分；足小趾關(guān)節(jié)紅腫計1 分；趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹計2 分；踝關(guān)節(jié)以下均紅腫計3 分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪的腫脹計4 分。關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）即每只大鼠四肢評分分數(shù)之和。評分達到6分以上即為造模成功。

1.4 分組與干預(yù)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后稱重標記，采用隨機數(shù)字表法選取10 只為正常組，其余大鼠均進行造模，將造模成功的大鼠再次稱重后按照體質(zhì)量分層原則隨機分為模型組、陽性藥組和刺山柑組，每組10 只。陽性藥組將甲氨蝶呤均勻混合于0.9%氯化鈉溶液，按照0.1 mg/100 g的劑量灌胃，每3 日1 次（每周2 次），共灌胃3 周。刺山柑組將刺山柑果實打粉粗提取，與45°白酒和蛋清（1∶2）混合均勻，適量外敷于大鼠左后足踝，紗布包裹并固定，敷藥每日1 h，連續(xù)敷藥6 天（1 個療程），間休1 天，共敷藥18 天（3 個療程）。敷藥過程中觀察大鼠，以防紗布脫落大鼠舔舐藥物。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況每日觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食攝水、活動度、毛發(fā)色澤和排便等一般情況。

1.5.2 AI 指數(shù)造模后3 天及每個療程后評價AI指數(shù)。

1.5.3 足爪容積造模和每個療程后采用排水法測量足爪容積。首先用標記筆在大鼠踝關(guān)節(jié)上方約l cm處畫圈做為標記，將水注滿10 mL玻璃刻度管，保持大鼠足部垂直插入水中至標記處后取出，動作盡量保持輕柔，再用裝滿水的5 mL注射器加水至原有水面高度，記錄注射器中剩余水量，其差值即為足爪所排出的水量，每次由專人進行測量，每次每只足爪測量2次取平均值。

1.5.4 ELISA 法檢測血清細胞因子含量末次給藥、治療和行為學測定后禁食禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥納（50 mg/kg）麻醉，將大鼠仰頭固定于手術(shù)臺，腹主動脈采血，真空管收集全血標本，室溫放置1 h 后離心半徑13.5 cm，3000 r/min 離心15 min，取上清液-20℃保存。采用ELISA 法檢測大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β含量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，組間兩兩比較方差齊時采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett"s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況大鼠造模后出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢、食欲下降，足部明顯腫脹、紅腫，活動明顯受限。

2.2 AI 指數(shù)評分大鼠造模后3 天AI 指數(shù)評分各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預(yù)后（第1療程），各組AI指數(shù)較模型組下降（P＜0.01），且在2、3療程有下降趨勢。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點AI指數(shù)評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠不同時間點AI指數(shù)評分比較（±s） 分

注：*表示與模型組比較，P＜0.01

2.3 大鼠足爪容積與正常組比較，造模后各組大鼠足爪容積均增加（P＜0.01）；第1 療程刺山柑組與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第2 療程陽性藥組與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，第1 療程刺山柑組降低（P＜0.05），陽性藥組在第2療程降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點足爪容積比較（±s） mL

表2 各組大鼠不同時間點足爪容積比較（±s） mL

注：與正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

2.4 血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23 和TGF-β 含量與正常組比較，模型組血清IL-17、IL-6、IL-23升高（P＜0.05），TGF-β、IL-10 降低（P＜0.05）；陽性藥組IL-6 高于正常組（P＜0.05），刺山柑組TGF-β低于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥組和刺山柑組IL-17、IL-6含量均降低（P＜0.05），IL-10 升高（P＜0.01）；刺山柑組IL-23 含量降低（P＜0.05）；各組TGF-β水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比較（±s） ph/mL

表3 各組大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比較（±s） ph/mL

注：與正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

3 討論

目前在RA 的治療方面，西醫(yī)主要以改善癥狀和緩解病情為主，民族醫(yī)藥在RA 的治療方面療效確切且安全、毒副作用小，有一定優(yōu)勢［5-6］。刺山柑屬白菜花科山柑屬植物，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，目前在我國主要分布在新疆、西藏、貴州等地，尤其在沙漠分布較多的新疆地區(qū)資源豐富。刺山柑的根、果、葉均能入藥，諸多藥理實驗表明，刺山柑果實較其他藥用部位更具有抗急性炎癥作用［7］。刺山柑在治療RA 方面具有祛風除濕、消炎止痛等功效［8］，其可能的作用機制是免疫抑制［9］、鎮(zhèn)痛、抗炎和抑制軟骨和骨破壞等作用［10］。

調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T 淋巴細胞17（T helper cell 17，Th17）參與自身免疫疾病、腫瘤、感染等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［11］。研究表明，保持RA 免疫穩(wěn)態(tài)存在Th17/Treg 平衡［12］，二者的抑炎及促炎性作用相輔相成［13-14］，在RA 患者外周血中Th17/Treg 比值明顯升高，并且與疾病活動度相關(guān)［15］。

Treg在許多自身免疫性疾病中較為關(guān)鍵［16-17］，具有降低炎性細胞因子產(chǎn)生抗體分泌功能，維持機體免疫內(nèi)環(huán)境平衡的作用。與Treg 功能相反，Th17 可促進自身免疫性疾病發(fā)生并介導促炎反應(yīng)［18］，主要分泌炎癥介質(zhì)IL-17。IL-17在RA中起關(guān)鍵作用，是一種重要的促炎性、前炎性細胞因子和炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，能夠通過多種途徑參與RA 的炎癥反應(yīng)和進行性損害。IL-17 既可以通過與其他細胞因子的相互作用以促炎，又可進一步誘導產(chǎn)生、釋放其他炎性因子，從而逐級放大炎癥效應(yīng)，導致RA 疾病的發(fā)生發(fā)展［19］。在維持Th17/Treg平衡中TGF-β的地位尤為重要，既可影響Th17細胞分化，又參與調(diào)節(jié)Treg 功能［1］。IL-10 是由Treg釋放的有發(fā)揮其抑制T細胞及抗原呈遞細胞的功能；IL-6 是多效性致炎性因子，由Treg細胞分泌產(chǎn)生，可誘導Th17細胞分化；IL-23主要在Th17細胞分化功能維持階段起主要作用［9］。

本研究結(jié)果表明，佐劑型關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清IL-17、IL-6、IL-23 升高，TGF-β降低。兩種干預(yù)方法均可有效降低主要由Th17 細胞分泌的促炎因子IL-17，此外，刺山柑還可有效降低Treg細胞分泌的致炎因子IL-6，升高抑炎因子IL-10，對于Th17和Treg分化共用的，具有雙向作用的調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β，以及主要起Th17 細胞分化功能維持作用的IL-23 無顯著改變，其具體機制有待進一步研究。因此，刺山柑可能是通過調(diào)節(jié)Th17和Treg 細胞水平，改善佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠免疫細胞Th17/Treg 失衡狀態(tài)，從而發(fā)揮其消炎及抑制足腫脹等作用。