冷凍消融去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)對(duì)脫氫野百合堿聯(lián)合低氧誘導(dǎo)犬肺動(dòng)脈高壓的療效研究

陳 浩 林銜亮 夏 印 黃藝生 陳 璟

1 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 福州 350025 2 福建省人民醫(yī)院血管外科，福建 福州 350025 3 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)放射診斷科，福建 福州 350025

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）屬于進(jìn)展性惡性疾病，其病理特征是肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓的進(jìn)行性增高，最終導(dǎo)致右心失代償甚至死亡。PH的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為在靜息狀態(tài)下，海平面高度右心導(dǎo)管測(cè)定肺動(dòng)脈平均 壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥20 mmHg （1 mmHg＝0.133 kPa）。PH的主要病理生理基礎(chǔ)包括血管內(nèi)皮功能障礙、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖、血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[1-2]。目前，PH的治療方法主要為藥物治療，如內(nèi)皮素受體拮抗劑，這些藥物可以降低肺動(dòng)脈壓力，但對(duì)預(yù)后無(wú)改善作用，且病死率仍居高不下。因此，越來(lái)越多的研究者對(duì)PH介入治療進(jìn)行了有益的探索。有研究在開胸狀態(tài)下，對(duì)哺乳動(dòng)物的交感神經(jīng)分布規(guī)律、特征以及外科損傷后肺動(dòng)脈壓力和右心室功能的改變進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究，指出局部損傷或干預(yù)肺動(dòng)脈交感神經(jīng)的完整性和功能后，哺乳動(dòng)物的肺動(dòng)脈壓力明顯改變[3]?；诖隧?xiàng)基礎(chǔ)研究，陳紹良教授率先提出肺動(dòng)脈去神經(jīng)術(shù)治療PH。美國(guó)心臟病學(xué)學(xué)會(huì)雜志發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于經(jīng)皮肺動(dòng)脈去神經(jīng)術(shù)（pulmonary artery denervation，PADN）的研究[4]，發(fā)現(xiàn)在主肺動(dòng)脈分叉及左右肺動(dòng)脈開口處實(shí)施PADN術(shù)，能夠明顯改善心肺功能狀態(tài)，降低肺動(dòng)脈壓力。但肺動(dòng)脈傳統(tǒng)熱消融法的消融時(shí)間較長(zhǎng)，患者的耐受性較差。近年來(lái)，心房顫動(dòng)冷凍消融手術(shù)的應(yīng)用不僅有效縮短了房顫手術(shù)時(shí)間，還減輕了患者的痛苦，避免了手術(shù)后的抗栓治療，具有很好的應(yīng)用前景，為去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)的應(yīng)用提供了一個(gè)全新的思路。本研究旨在評(píng)估冷凍球囊消融（簡(jiǎn)稱冷凍消融）去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)治療PH的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用15只普通級(jí)雄性成年比格犬，7～11月齡，體重8～13 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開發(fā)有限公司，動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（閩）2018-0001，動(dòng)物合格證號(hào)為1108392011000026。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)為SYXK（閩）2018-0005，正常飲食，自由飲水。按照隨機(jī)數(shù)字表法將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，分別為A組（脫氫野百合堿模型組）、B組（脫氫野百合堿+低氧模型組）和C組[對(duì)照組（二甲基酰胺注射組）]，每組5只。

1.2 方法

1.2.1 脫氫野百合堿PH犬模型建立

犬保留自主呼吸狀態(tài)，進(jìn)行3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。首先，采用Mattocks法對(duì)野百合堿進(jìn)行脫氫處理[5]，脫氫后將其溶解于0.1 ml/kg的二甲基酰胺中保存?zhèn)溆?。?jīng)Swan-Ganz導(dǎo)管進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定，后將脫氫野百合堿（3 mg/kg）注入右心室，4周后重復(fù)進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定。采用Seldinger法穿刺右股靜脈，置入靜脈鞘，經(jīng)鞘管將5F Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管依次送至右心房、右心室、肺動(dòng)脈，測(cè)定中心靜脈壓、右心房壓力、右心室壓力、肺動(dòng)脈平均壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）和肺毛細(xì)血管楔嵌壓（pulmonary capillary wedge pressure，PCWP）。使用Biosense Webster MP 160 NICO電生理記錄儀監(jiān)測(cè)mPAP、PCWP和心輸出量。模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)為右心導(dǎo)管測(cè)量的肺動(dòng)脈平均壓力超過(guò)30 mmHg，即可認(rèn)為建模成功。

1.2.2 脫氫野百合堿聯(lián)合低氧PH犬模型建立

犬保留自主呼吸狀態(tài)，進(jìn)行3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。首先，采用Mattocks法對(duì)野百合堿進(jìn)行脫氫處理[5]，脫氫后將其溶解在0.1 ml/kg的二甲基酰胺中保存?zhèn)溆?。?jīng)Swan-Ganz導(dǎo)管進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定，后于第1天一次將脫氫野百合堿（3 mg/kg）注入右心室，第2～28天暴露于低氧[吸入氣氧濃度（fractional concentration of inspired oxygen，F(xiàn)iO2）10%]、低 壓（380 mmHg）的DWC-300/0.7型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙（購(gòu)自山東煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)股份有限公司）中28 d。每周開三次減壓室進(jìn)行動(dòng)物護(hù)理和清潔，所有動(dòng)物均可以獲得足量的食物和水。

1.2.3 冷凍球囊消融去肺動(dòng)脈神經(jīng)術(shù)

具體方法：（1）3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，按照0.04 mg/kg的劑量肌肉注射硫酸阿托品注射液，于動(dòng)物房成功麻醉，然后取犬將其仰臥位固定于導(dǎo)管室手術(shù)臺(tái)。備皮后，監(jiān)測(cè)心電圖和動(dòng)脈血壓。（2）選取犬左右側(cè)股靜脈為穿刺動(dòng)脈，備皮后，常規(guī)消毒、鋪巾。（3）行股靜脈血管插管，在右側(cè)腹股溝韌帶下方2 cm處觸及股動(dòng)脈搏動(dòng)，于內(nèi)測(cè)0.5～1.0 cm處進(jìn)行定位，采用18號(hào)穿刺針斜面向上進(jìn)針，針尖指向股靜脈處，與皮膚呈30°～45°的角度進(jìn)針，當(dāng)有暗紅色血液流出時(shí)，固定穿刺針，送入導(dǎo)絲，撤出穿刺針；切開表層皮膚，分離皮下組織，暴露股靜脈；保持視野清晰，后經(jīng)導(dǎo)絲置入9F鞘管，退出導(dǎo)絲，經(jīng)鞘管注入低分子肝素生理鹽水抗凝。（4）安裝血壓監(jiān)測(cè)設(shè)備，并記錄犬的基線血壓。（5）在X光透視下將導(dǎo)引導(dǎo)絲送入肺動(dòng)脈遠(yuǎn)端，經(jīng)導(dǎo)引導(dǎo)絲送入冷凍球囊至肺動(dòng)脈開口，在肺動(dòng)脈口部充盈球囊造影證實(shí)球囊封堵住肺動(dòng)脈口，后球囊充氣冷凍，分6次間隔冷凍，每次持續(xù)1～2 min。（6）置入Achieve導(dǎo)管至肺動(dòng)脈開口，測(cè)量肺動(dòng)脈交感神經(jīng)電位，驗(yàn)證肺血管內(nèi)膜交感神經(jīng)電位是否成功隔離。

1.2.4 樣本采集

（1）血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管收集血液，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。以3000 r/min的速度對(duì)收集后的血液進(jìn)行離心，離心時(shí)間為10 min，將血清和紅細(xì)胞迅速且小心地進(jìn)行分離。（2）采用EDTA、檸檬酸鹽或肝素對(duì)血漿進(jìn)行抗凝，并以3000 r/min的速度對(duì)上清液進(jìn)行離心，離心時(shí)間為30 min。（3）以3000 r/min的速度對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行離心，離心時(shí)間為10 min，去除顆粒和聚合物。（4）組織勻漿∶將組織加入適量生理鹽水并搗碎，以3000 r/min的速度對(duì)上清液進(jìn)行離心，離心時(shí)間為10 min。（5）若樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20 ℃環(huán)境下，避免反復(fù)凍融，于室溫下解凍并確保樣品均勻、充分解凍。

1.3 觀察指標(biāo)

比較建模前3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般資料，包括年齡、體重、mPAP、PCWP和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平。測(cè)定并比較冷凍消融術(shù)前后3組實(shí)驗(yàn)犬的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即能夠反映肺動(dòng)脈壓力的指標(biāo)mPAP、PCWP。使用Biosense Webster MP 160 NICO電生理記錄儀監(jiān)測(cè)3組實(shí)驗(yàn)犬冷凍消融術(shù)前后的mPAP、PCWP。采用犬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定并比較冷凍消融術(shù)前后3組實(shí)驗(yàn)犬的 VEGF水平，檢測(cè)試劑盒由上海極威生物科技有限公司購(gòu)買提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組實(shí)驗(yàn)犬建模前一般資料的比較

建模前，3組比格犬的月齡、體重、VEGF、PCWP、mPAP比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 3組實(shí)驗(yàn)犬一般資料的比較（±s）

表1 3組實(shí)驗(yàn)犬一般資料的比較（±s）

注：VEGF.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；PCWP.肺毛細(xì)血管楔嵌壓；mPAP.肺動(dòng)脈平均壓

臨床特征 A組（n＝5）B組（n＝5）C組（n＝5） F值P值年齡（月） 10.83±0.56 9.72±2.19 10.73±1.06 1.870.08體重（kg） 10.88±2.33 11.27±1.78 10.29±1.75 3.140.09 VEGF（pg/ml）112.00±8.00101.00±14.0099.00±12.004.290.10 PCWP（mmHg） 7.23±3.10 7.43±2.63 8.17±1.26 3.260.08 mPAP（mmHg） 10.27±2.53 11.56±1.44 10.21±3.25 2.670.16

2.2 3組實(shí)驗(yàn)犬手術(shù)前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比較

術(shù)前，3組實(shí)驗(yàn)犬的PCWP、mPAP、VEGF水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后第6個(gè)月，A、B組實(shí)驗(yàn)犬的mPAP 、PCWP、VEGF水平均低于本組術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.481、2.427、1.743，P＜0.05）。術(shù)后第6個(gè)月，3組實(shí)驗(yàn)犬的mPAP、PCWP、VEGF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.257、1.891、1.0125，P＜0.05）。術(shù)后第6個(gè)月，B組實(shí)驗(yàn)犬的mPAP、PCWP、VEGF水平均低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.681、3.569、1.047，P＜0.05，表2）。

表2 3組實(shí)驗(yàn)犬手術(shù)前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比較（±s）

表2 3組實(shí)驗(yàn)犬手術(shù)前后PCWP、mPAP、VEGF水平的比較（±s）

注：與本組術(shù)前比較，aP＜0.05；與B組術(shù)后比較，bP＜0.05

指標(biāo) 時(shí)間A組（n＝5）B組（n＝5）C組（n＝5）mPAP 術(shù)前30.217±2.645 55.629±2.38610.767±3.545（mmHg）術(shù)后14.243±1.258a b12.436±1.689a12.897±1.622 PCWP 術(shù)前17.063±1.885 32.342±1.687 8.244±1.927（mmHg）術(shù)后 9.369±1.591a b 8.991±2.724a 8.875±2.898 VEGF 術(shù)前 257±15 338±16 108±12（pg/ml）術(shù)后 114±7a b 98±11a 111±9

3 討論

近年來(lái)，PH的治療取得了開創(chuàng)性進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，一些功能失調(diào)的內(nèi)皮源性通路參與了PH的特征性血管重塑[6]。以功能失調(diào)的內(nèi)皮源性通路為藥理學(xué)靶點(diǎn)，一些新的介入技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，從而被應(yīng)用于特定的患者。例如，房間隔造口術(shù)及肺動(dòng)脈球囊血管成形術(shù)被認(rèn)為是治療無(wú)法接受手術(shù)的PH和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)極高患者的一種有效方法[7-8]。近年來(lái)，肺動(dòng)脈去神經(jīng)術(shù)使更多的PH患者獲得更多的臨床獲益。

臨床研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)在PH患者中會(huì)被激活[9]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，PH患者血漿中的去甲腎上腺素水平升高，并且與肺動(dòng)脈壓力、肺血管阻力有關(guān)[10]。交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可能是PH患者肺血管重塑和右心室功能障礙的促進(jìn)因素[11]。因此，心率增快和骨骼肌交感神經(jīng)活性增強(qiáng)是PH患者的主要臨床特征[12-13]。但是，降低全身交感神經(jīng)活性的藥物β受體阻滯劑并不能有效降低PH。由此推測(cè)，除了PH患者的全身交感神經(jīng)被激活之外，可能局部交感神經(jīng)被激活發(fā)揮了更重要的作用，為更精準(zhǔn)地隔離肺動(dòng)脈交感神經(jīng)提供了理論依據(jù)。

Zhou等[14]的研究結(jié)果表明，PADN可以改善PH動(dòng)物模型的血流動(dòng)力學(xué)和心臟結(jié)構(gòu)，降低肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力，減輕右心室肥厚，部分逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)。此外，在野百合堿誘導(dǎo)的PH犬中，肺血管收縮、增殖的細(xì)胞因子和介質(zhì)的mRNA的表達(dá)水平有所升高；PADN后，這些因子的表達(dá)水平明顯降低，并且這些效應(yīng)可持續(xù)至少幾個(gè)月，表明該手術(shù)可以永久性隔離肺動(dòng)脈交感神經(jīng)。Chen等[4]的研究證實(shí)了PADN的安全性和療效，結(jié)果表明，對(duì)行PADN術(shù)的患者進(jìn)行3個(gè)月隨訪時(shí)的mPAP明顯下降，超聲指標(biāo)Tei指數(shù)也明顯得到改善，但肺動(dòng)脈傳統(tǒng)熱消融法的消融時(shí)間較長(zhǎng)，患者耐受性差。

近年來(lái)，房顫冷凍消融手術(shù)得到廣泛應(yīng)用，不經(jīng)縮短了房顫手術(shù)時(shí)間，還減輕了患者的痛苦，避免了手術(shù)后的抗栓治療，具有很好的應(yīng)用前景。本研究開展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了不論是在脫氫野百合堿誘導(dǎo)的PH模型中，還是在脫氫野百合堿聯(lián)合低氧誘導(dǎo)的PH模型中，術(shù)后，mPAP和PCWP均會(huì)明顯降低，血液中的VEGF水平均較術(shù)前明顯降低；與B組比較，A組實(shí)驗(yàn)犬的mPAP、PCWP、VEGF水平均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明局部損傷或干預(yù)肺動(dòng)脈交感神經(jīng)的完整性和功能后，比格犬的肺動(dòng)脈壓力可發(fā)生顯著變化，且術(shù)后表現(xiàn)出了降低肺動(dòng)脈壓力效果的可延續(xù)性。其中，在脫氫野百合堿聯(lián)合低氧模型的冷凍消融術(shù)中，表現(xiàn)出了很好的降低肺動(dòng)脈壓力及VEGF效果，同時(shí)說(shuō)明冷凍消融術(shù)在去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)操作方面的可行性，為PH的未來(lái)治療提供了全新的思路，為未來(lái)治療人類PH提供了先進(jìn)的手段。

綜上所述，冷凍球囊消融去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)是治療PH的一種有效手段，其從神經(jīng)調(diào)節(jié)層面降低了肺動(dòng)脈的高壓力。由于PH發(fā)病的復(fù)雜性，從體液細(xì)胞學(xué)層面干預(yù)PH亦是一個(gè)值得探討的問(wèn)題[15]。本研究中通過(guò)分析結(jié)果顯示，與其他兩種模型相比，冷凍球囊消融去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)有效降低了脫氫野百合堿聯(lián)合低氧模型實(shí)驗(yàn)犬的肺動(dòng)脈壓力和VEGF水平，對(duì)于出現(xiàn)此種差異的原因仍需進(jìn)一步進(jìn)行模型的病理生理分析，亦將是今后的研究方向。