急性Stanford B型主動(dòng)脈夾層犬模型建立的實(shí)驗(yàn)方法研究

羅光澤 戴向晨 潘紅瑞 李文健 曲 超 李宏偉 孫 昊 李 鵬 朱杰昌

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血管外科，天津 300052

主動(dòng)脈夾層（aortic dissection，AD）是一種進(jìn)展快、致死率極高的大血管疾病，其主要治療方式包括開放手術(shù)、雜交手術(shù)及腔內(nèi)手術(shù)。近年來，隨著腔內(nèi)技術(shù)的不斷發(fā)展，AD治療方式逐漸由開放手術(shù)向微創(chuàng)治療轉(zhuǎn)變[1-2]。胸主動(dòng)脈腔內(nèi)修復(fù)術(shù)（thoracic endovascular aortic repair，TEVAR）是目前臨床治療Stanford B型AD的首選治療方法[3-4]，但實(shí)踐操作顯示該治療手段尚存在許多技術(shù)難題丞待解決，如支架植入后并發(fā)癥的處理、病理生理學(xué)變化、流體力學(xué)改變等，這些仍需要通過穩(wěn)定的動(dòng)物模型來進(jìn)行評(píng)價(jià)[5-6]。因此，構(gòu)建一種可重復(fù)且穩(wěn)定性好的動(dòng)物模型在AD的血流動(dòng)力學(xué)研究及腔內(nèi)治療方面具有較高價(jià)值。本研究通過多機(jī)制聯(lián)合的建模方法成功并穩(wěn)定建立了急性Stanford B型主動(dòng)脈夾層（acute Stanford B type aortic dissection，aTBAD）動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用10只成年健康雜種犬[SCXK（津）2016-001]，體重18～25 kg，平均體重（21.1±2.3）kg，24～48月齡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外研究所購買提供，遵守天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品

肝素鈣注射液（體積1 ml，1萬單位/支）（天津生物化學(xué)制藥有限公司）、彈性蛋白酶（Elastase）（美國Acmec公司）、氯化琥珀膽堿注射液（西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司）、鹽酸賽拉嗪注射液（體積2 ml，每支40 mg）（吉林省方正動(dòng)物藥業(yè)科技有限責(zé)任公司）、苯巴比妥鈉（體積1 ml，每支0.1 g）（天津金耀藥業(yè)有限公司），鹽酸腎上腺素注射液（體積1 ml，每支1 mg）（天津金耀藥業(yè)有限公司），所有實(shí)驗(yàn)藥品均在使用期內(nèi)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

神經(jīng)剝離子購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司； 超滑超硬導(dǎo)絲購自日本Terumo公司；4F-VER導(dǎo)管購自美國Cordis公司；4～20 mm或6～20 mm球囊擴(kuò)張導(dǎo)管購自美國Medtronic公司；Matrx Model 3000型動(dòng)物呼吸機(jī)購自Midmark Corporation公司；計(jì)算機(jī)體層血管成像（computed tomography angiography，CTA）儀器購自德國Siemens公司；數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）購自荷蘭Philips公司；5-0 Prolene縫線購自美國Johnson&Johnson公司。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及開胸手術(shù)

采用苯巴比妥鈉，5～10 mg/kg肌注麻醉前鎮(zhèn)靜；鹽酸賽拉嗪注射液，1 mg/kg對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行鎮(zhèn)靜后麻醉，右側(cè)臥位，向前拉伸左前肢，建立靜脈通路后氣管插管，予以肌松后給予呼吸通氣支持。術(shù)野進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾后，沿第3/4肋間開胸，分離顯露降主動(dòng)脈，于動(dòng)脈切口遠(yuǎn)近端分別留置阻斷帶。

1.2.2 分離中膜

分離中膜先提起主動(dòng)脈阻斷帶，限制其彈性搏動(dòng)，縱向切開主動(dòng)脈外膜至中膜的內(nèi)1/3層。使用神經(jīng)剝離子分離中膜間隙，超滑超硬導(dǎo)絲配合單彎導(dǎo)管（4F-VER導(dǎo)管）沿中膜間隙向遠(yuǎn)端分離，并不斷調(diào)整導(dǎo)絲導(dǎo)管前進(jìn)方向，分離長度為5～10 cm，利用4～20 mm或6～20 mm球囊擴(kuò)張導(dǎo)管由近向遠(yuǎn)逐步擴(kuò)張中膜間隙（圖1A），球囊至最遠(yuǎn)端時(shí)保持?jǐn)U張狀態(tài)，經(jīng)球囊導(dǎo)管注入彈性蛋白酶注射液（500 U/ml），維持20～30 min后撤出[3]。

1.2.3 建立夾層近端破口

采用阻斷鉗阻斷主動(dòng)脈切口近、遠(yuǎn)端，橫向剪去 3 mm×7 mm左右內(nèi)膜（圖1B），用5-0 Prolene縫線將遠(yuǎn)端內(nèi)膜雙角縫至于主動(dòng)脈側(cè)壁全層，保證近端破口的橫截面積占主動(dòng)脈橫截面積的1/2～2/3，使夾層內(nèi)膜破口處于開放狀態(tài)（圖1C）；最后縫合外膜（圖1D）。

圖1 術(shù)中建模過程

1.2.4 低劑量腎上腺素升壓

松開主動(dòng)脈阻斷鉗，同時(shí)放松遠(yuǎn)近端阻斷帶；靜脈注射腎上腺素（0.03～0.05 mg/kg），使收縮壓維持在180 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）以上，同時(shí)使用紗布按壓主動(dòng)脈外膜縫合口以防止破裂出血，觀察20 min，若無明顯出血及其他異常即可關(guān)閉胸腔。

1.2.5 術(shù)后檢查及病理分析

術(shù)后即時(shí)行CTA或DSA檢查，觀察夾層形成情況、累及長度等。并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死并解剖實(shí)驗(yàn)犬，取主動(dòng)脈標(biāo)本實(shí)體觀察夾層形成情況；另外分別采用蘇木精-伊紅（HE）染色、Movat染色及Verhoeff's Van Gieson（EVG）染色進(jìn)行病理學(xué)分析，觀察夾層形成后中膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組織學(xué)改變等。建模成功定義為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后存活至少48 h以上，術(shù)后經(jīng)CTA或CTA檢查驗(yàn)證夾層形成且長度至少大于5.0 cm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 夾層形成情況

10只實(shí)驗(yàn)犬的夾層建模術(shù)后存活率為70%（7/10）。共3只實(shí)驗(yàn)犬死亡，其中術(shù)中死亡1只，死因?yàn)樾g(shù)中主動(dòng)脈夾層遠(yuǎn)端外膜撕裂出血，術(shù)后取標(biāo)本可見夾層形成；術(shù)后24 h內(nèi)死亡2只，死因考慮為與術(shù)中阻斷時(shí)間過長引起的心臟衰竭有關(guān)，并解剖實(shí)驗(yàn)取犬主動(dòng)脈標(biāo)本觀察，發(fā)現(xiàn)均形成夾層且累及長度大于5.0 cm。松開主動(dòng)脈阻斷鉗，并同時(shí)升壓，直視下可觀察到夾層立即向遠(yuǎn)端撕裂，管壁膨大、壓力增高，主動(dòng)脈直徑明顯較強(qiáng)增粗，管壁變薄。

2.2 術(shù)后影像學(xué)檢查結(jié)果

術(shù)后即時(shí)DSA檢查、CTA檢查及解剖標(biāo)本驗(yàn)證夾層結(jié)果顯示：夾層形成率為100%（10/10）。建模成功率為70%（7/10），其中6例累及內(nèi)臟動(dòng)脈；夾層長度為7.5～17.5 cm，平均累及長度（14.54±3.03）cm。通過DSA檢查可以動(dòng)態(tài)顯示夾層真假腔及撕裂程度、真假腔血流改變、夾層遠(yuǎn)端及內(nèi)臟供血情況（圖2A）。CTA影像顯示夾層真、假雙腔形態(tài)及累及程度，形成的夾層假腔大于真腔，撕裂分離的夾層內(nèi)膜片呈條形低密度影（圖2B～C）。近端破口均位于距左鎖骨下動(dòng)脈1.5～2.5 cm的降主動(dòng)脈。

圖2 建模術(shù)后DSA及CTA檢查圖

2.3 主動(dòng)脈標(biāo)本及病理結(jié)果

術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死并解剖實(shí)驗(yàn)犬，取血管標(biāo)本可見主動(dòng)脈管壁彈性降低，夾層假腔內(nèi)有血栓形成，夾層累及至腹腔干動(dòng)脈水平并形成遠(yuǎn)端夾層破口（圖3A）；通過主動(dòng)脈標(biāo)本橫截面上外觀可見夾層假腔明顯，其直徑占同水平主動(dòng)脈直徑的1/2～2/3，而真腔被壓縮（圖3B）。HE染色結(jié)果顯示，夾層主動(dòng)脈壁呈現(xiàn)出明顯中膜分離狀態(tài)，主動(dòng)脈壁中膜結(jié)構(gòu)破壞，組織層次紊亂，細(xì)胞核減少（圖3C）；Movat染色結(jié)果顯示，可見中膜層結(jié)構(gòu)變化，部分彈性纖維斷裂，出現(xiàn)板層分離，外側(cè)壁彈性纖維過度拉伸而出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變（圖3D），其中彈性纖維及細(xì)胞核呈紫黑色，膠原蛋白及網(wǎng)狀纖維呈黃色，肌纖維呈淺紅色。EVG染色法結(jié)果顯示，可見內(nèi)臟動(dòng)脈水平的主動(dòng)脈管壁組織層次有明顯差異，主動(dòng)脈管壁三層結(jié)構(gòu)分明，而在內(nèi)臟動(dòng)脈開口處出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，內(nèi)臟動(dòng)脈彈性纖維減少且趨向于中膜的外1/3層（圖3E）；圖3F示夾層累及至內(nèi)臟動(dòng)脈水平。

3 討論

目前臨床建立aTBAD大動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)方法主要為腔內(nèi)和開放手術(shù)，已有文獻(xiàn)顯示，采用開胸手術(shù)為主要方式[7-9]。Blanton等[10]于1959年通過外科手術(shù)方式建立實(shí)驗(yàn)犬夾層模型，但結(jié)果顯示夾層成模率較低，且多形成局部夾層動(dòng)脈瘤。后來，國內(nèi)外在此基礎(chǔ)上不斷進(jìn)行改進(jìn)，同時(shí)也獲得良好的研究成果[11-14]。Cui等[15]采用“內(nèi)膜雙角縫合”構(gòu)建了較為明顯的夾層真假腔，且AD建模成功率明顯提高，達(dá)66.7%，但同時(shí)結(jié)果顯示該方法的夾層遠(yuǎn)端累及并不顯著。部分學(xué)者也嘗試通過腔內(nèi)手術(shù)或機(jī)械擴(kuò)張聯(lián)合腎上腺素沖擊構(gòu)建aTBAD模型，但研究顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病死率和夾層破裂風(fēng)險(xiǎn)均較高，夾層的建模成功率不理想[16-19]。對(duì)于aTBAD動(dòng)物模型的構(gòu)建，夾層的形成長度和累及范圍仍是主要難點(diǎn)，尤其對(duì)于累及內(nèi)臟動(dòng)脈區(qū)的aTBAD動(dòng)物模型[20]。因此構(gòu)建更符合臨床特點(diǎn)的aTBAD動(dòng)物模型具有重要的意義和實(shí)驗(yàn)價(jià)值。

本研究根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，通過不斷改進(jìn)，最后采用多機(jī)制聯(lián)合的建模法成功建立aTBAD模型。本研究利用超滑超硬導(dǎo)絲配合單彎導(dǎo)管向遠(yuǎn)端分離中膜層間隙，由于導(dǎo)絲頭端具有良好的柔順性和支持力，同時(shí)配合單彎導(dǎo)管頭端彎度不斷調(diào)整導(dǎo)絲導(dǎo)管前進(jìn)方向，從而建成更多的夾層腔隙或通道，再配合球囊機(jī)械擴(kuò)張，容易形成更大的夾層腔，再經(jīng)球囊導(dǎo)管灌注彈性蛋白酶充分溶解了中膜層彈性纖維組織等，此過程是在未阻斷主動(dòng)脈的情況下操作完成，可以減少術(shù)中并發(fā)癥的發(fā)生，增加了夾層累及長度并且更易于累及內(nèi)臟分支動(dòng)脈。本實(shí)驗(yàn)建模成功是指建模術(shù)后動(dòng)物存活至少48 h以上并經(jīng)檢查驗(yàn)證aTBAD形成，因此排除急性創(chuàng)傷后并發(fā)癥及急性夾層較高死亡風(fēng)險(xiǎn)因素等造成實(shí)驗(yàn)犬死亡的情況，模型成功率達(dá)70%。而術(shù)后夾層形成率為100%，并且內(nèi)臟動(dòng)脈累及率可達(dá)60%，表明本實(shí)驗(yàn)的研究方法具有可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示夾層長度為7.5～17.5 cm，平均累及長度（14.54±3.03）cm。本研究組有熟練的aTBAD動(dòng)物建模經(jīng)驗(yàn)，能夠不阻斷主動(dòng)脈的同時(shí)較短時(shí)間內(nèi)分離主動(dòng)脈中膜，從而減少術(shù)中并發(fā)癥的發(fā)生并且有效地增加的夾層的累及長度。

圖3 術(shù)后犬主動(dòng)脈標(biāo)本及病理結(jié)果

本研究還采用“內(nèi)膜雙角縫合”法使AD近端破口維持開放狀態(tài)，并保證破口大小，防止假腔過大將真腔全部壓閉，避免血栓發(fā)生形成局部夾層動(dòng)脈瘤，從而增加了aTBAD建模成功率。術(shù)后給予低劑量腎上腺素（0.03～0.05 mg/kg）升高實(shí)驗(yàn)犬血壓，利于aTBAD快速形成，又可防止動(dòng)物血壓過高引起夾層破裂。

本研究通過多種方法驗(yàn)證夾層形成情況，其中CTA作為確定主動(dòng)脈夾層的方法，具有重復(fù)性強(qiáng)、損傷小的特點(diǎn)，可以更好地顯示夾層的范圍、破口的位置等。DSA檢查可以動(dòng)態(tài)顯示出夾層真假腔及撕裂程度，顯示真假腔血流改變，以及夾層遠(yuǎn)端和內(nèi)臟供血情況。通過HE染色結(jié)果觀察到夾層主動(dòng)脈壁呈現(xiàn)出明顯中膜分離狀態(tài)；Movat染色示中膜層出現(xiàn)彈性纖維斷裂及板層分離狀態(tài)；動(dòng)脈血管EVG染色為內(nèi)臟分支動(dòng)脈區(qū)的動(dòng)脈管壁解剖提供更加直觀的參考價(jià)值。

綜上所述，本研究的優(yōu)勢(shì)在于aTBAD建模的可控性及增加了夾層累及長度，提高了建模的安全性和有效性。研究不足之處為總體樣本量較小，且缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)犬的長期觀察，此外，對(duì)于夾層形成后的血流動(dòng)力學(xué)研究仍在進(jìn)行中，尚無法提供該模型與人類夾層的比較分析。