PD-1 抗體聯(lián)合CXCL10 對肝癌的抑制作用及其機制研究

楊圓圓，林芳珍，范冬梅，楊 銘*

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300020；2.中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院，中國醫(yī)學科學院血液學研究所，天津 300020）

肝癌是世界第五大常見惡性腫瘤，在我國位列第二，近年來肝癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢［1］。至今，手術仍然是肝癌治療的首選，但僅有少數(shù)患者適合手術切除［2］。對于失去手術機會和復發(fā)的肝癌患者，尋找藥物治療的新方法、新途徑仍是研究熱點。近年來腫瘤免疫治療的新策略和新思路得到廣泛的研究和發(fā)展，并為傳統(tǒng)治療注入新的活力。其中又以PD-1/PD-L1通路抑制劑在實體瘤中的治療效果最為顯著，目前已應用于黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤。有文獻總結了免疫治療藥物發(fā)揮作用的三個要素［3］，即腫瘤的突變負荷、腫瘤內部淋巴細胞的浸潤情況以及PD-L1 的表達水平。CXCR3/CXCL10 趨化軸是T 細胞遷移的重要信號通路，CXCL10 可以招募多種免疫細胞直接殺傷腫瘤細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，提高患者總生存率。腫瘤部位CXCL10 的表達缺陷可能是造成腫瘤免疫逃逸的作用機制之一［4-6］?；谝陨涎芯浚P者推測CXCL10 能夠促進PD-1 抗體的抗腫瘤作用。本研究以腺病毒為載體使腫瘤細胞表達PD-1 抗體及趨化因子CXCL10，探討其對HepG2 細胞的生長抑制作用及其機制，以期為腫瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c 裸鼠15 只（5～6 周齡，體重15～20 g，雌性），購自北京維通利華實驗技術有限公司，飼養(yǎng)于實驗血液學國家重點實驗室SPF 級實驗動物房，實驗動物許可證號為：SYXK（津）2020-0003。動物實驗方案遵循實驗動物倫理的相關規(guī)定。

1.1.2 主要儀器設備 電泳儀（型號：200/2.0 型，BIORAD 公司），全自動凝膠成像系統(tǒng)（型號：Tanon1600，上海天能），恒溫金屬浴（型號：DKT200-2A，杭州米歐儀器有限公司），恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermal Scientific），倒置顯微鏡（型號：CKX41，日本OLYMPUS），熒光/化學發(fā)光成像分析儀（型號：ImageQuant LAS-4010，GE 公司），Synergy H4 多功能酶標儀（型號：Synergy H4，Bio Tek公司），流式細胞分析儀（型號：FACSCantoII，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝細胞癌細胞系HepG2、人胚腎細胞系293A 由本實驗室保存。使用含10%FBS 及2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 腺病毒穿梭質粒的構建及病毒包裝 包裝腺病毒所使用的穿梭質粒為pAd-AFP-anti-PD-1-CXCL10，合成anti-PD-1 單鏈抗體及CXCL10 堿基序列。將穿梭質粒與pAdEasy-1 骨架質粒正確重組后，根據(jù)Adeasy 腺病毒包裝手冊說明于293A 細胞中包裝腺病毒。轉染10～14 d 后出現(xiàn)細胞病變效應，反復凍融病毒上清三次收集為第一代病毒。繼續(xù)傳兩代收集第三代病毒，于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 檢測目的蛋白表達 取對數(shù)生長期的HepG2 及MCF-7 細胞，調整細胞密度為1.5×105/ml，接種于六孔板，待細胞沉于孔板底部后，按100 MOI 的感染復數(shù)分別加入腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10或對照病毒Ad-track，48 h 后采用Western Blot 方法檢測蛋白表達。

1.2.4 ELISA 檢測分泌蛋白的表達 根據(jù)CXCL10 ELISA 檢測試劑盒（eBioscience）檢測病毒感染后細胞上清，具體操作如下：取50 μl Standards 或樣品加入酶標板中（每個樣品設置復孔）。于所有復孔中分別加入50 μl 酶標抗體，室溫封閉孵育30 min。260 μl Wash Solution 洗板4 次。每孔加入100 L TMB 底物液，室溫孵育10～15 min。每孔中加入50 μl 終止液以終止酶反應，酶標儀測定450 nm 處吸光度。繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中CXCL10 的濃度。

1.2.5 檢測活化T 細胞CD8 陽性群體中CXCR3 陽性率 取外周血單個核細胞（PBMC），調整細胞密度為2×106/ml，加入終濃度為0.5 μg/ml 的anti-CD3 及anti-CD28 抗體。于0、3、6 和9 d 收集細胞，流式細胞儀檢測CD8 陽性細胞CXCR3 表達水平。

1.2.6 檢測共培養(yǎng)后HepG2 細胞PD-L1 陽性率 取對數(shù)生長期的HepG2 細胞，調整細胞密度為1×105/ml，待細胞沉于板底部，以不同比例（2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1）加入活化后的T 細胞，72 h 后收集細胞，流式細胞儀檢測HepG2 細胞表面PD-L1 表達水平。

1.2.7 Transwell 檢測CXCL10 對T 細胞的趨化作用 取感染病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 后的HepG2 培養(yǎng)上清600 μl，并使用CXCL10 因子作為陽性對照（終濃度為10 ng/ml）。將Transwell 小室放入孔板中，于細胞培養(yǎng)箱預平衡1 h。期間，收集anti-CD3、anti-CD28抗體激活后的T 細胞1×106個置于上室。3 h 后，吸取300 μl 下室細胞，加入50 μl 計數(shù)Beads（123 count eBioscience），充分混勻后流式檢測Beads 所占比例，并計算下室細胞數(shù)。

1.2.8 Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對BALB/c 裸鼠HepG2 移植瘤生長抑制作用 選用BALB/c 裸鼠（雌性，5～6 周齡，體重16～18 g）建立人肝細胞癌HepG2細胞系移植瘤模型。接種前1 d，以300 cGy/只的劑量進行γ 射線照射。收集對數(shù)生長期的HepG2 細胞，于小鼠右前肢根部背側皮下接種，每只接種200 μl HepG2細胞懸液（5×106/只）。待腫瘤生長至100～200 mm3時進行實驗。每周兩次瘤內注射濃縮后的腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，并經尾靜脈注射活化后的T細胞（5×106/只）。隔日記錄腫瘤長寬，并計算體積。

2 結果

2.1 腺病毒表達載體的構建及蛋白的表達 如圖1 A所示，構建腺病毒表達載體，經測序驗證其正確性。Western blot 結果顯示，感染腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10（DOUBLE）后，HepG2 中anti-PD-1，CXCL10均能正確表達。而MCF-7 細胞由于缺乏AFP 啟動子活性不能表達目的蛋白（圖1 B）。目的條帶與相應內參灰度值之比見圖1 C。ELISA 結果表明HepG2 培養(yǎng)上清中分泌的CXCL10 濃度約為（1.35±0.33）ng/ml（圖1 D）。

2.2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細胞相互作用過程中激活 經anti-CD3、anti-CD8 抗體活化后CD 8 陽性T 細胞CXCR3 表達逐漸上調（圖2 A），CXCL10 可通過與其受體結合募集活化T 細胞。HepG2與活化后T 細胞相互作用可使其PD-L1 表達上調，并且PD-L1 陽性比例隨效靶比例增加而進一步升高，20∶1 時可達71.1%（圖2 B）。過往的研究中已經證實T細胞激活后其PD-1 表達水平上調［7］，故PD-1/PD-L1通路可在效靶細胞相互作用過程中激活。

圖1 腺病毒表達載體的構建及蛋白的表達

圖2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細胞相互作用過程中激活

2.3 CXCL10 對活化T 細胞趨化作用 本研究采用Transwell 的方法在體外檢測活化后的T 細胞的趨化性，使用流式細胞術對遷移到下室的細胞進行計數(shù)。結果顯示，Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 組與陽性對照組（加入CXCL10 因子）不存在明顯差異，而對T 細胞趨化效果明顯強于對照組（Adtrack 感染組）（圖3）。說明由感染病毒后的HepG2 細胞分泌的CXCL10 可有效募集活化T 細胞。

圖3 CXCL10 可趨化活化T 細胞

2.4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對BALB/c裸鼠HepG2 皮下移植瘤生長的抑制作用 濃縮腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，50 μl/只瘤內給藥治療，并以PBS 作為對照組，同時經尾靜脈給予活化的T細胞。HepG2 細胞移植瘤裸鼠接受治療后，每3 d 測量一次腫瘤體積，動態(tài)觀察腫瘤的生長狀況。結果顯示，盡管與PBS 組相比不具有顯著差異，腺病毒Ad-AFPanti-PD-1-CXCL10 可一定程度減慢HepG2 腫瘤的生長，抑制率約為28.66 %，欠佳的治療效果可能與病毒用量及注射的T 細胞數(shù)量相關。見圖4。

圖4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對HepG2 皮下移植瘤的治療作用

3 討論

本研究聯(lián)合PD-1 抗體與趨化因子治療肝細胞癌，探討了相關理論基礎，證明了聯(lián)合用藥機制上的可行性，并對體內抑瘤效果進行了初步評價。結果表明，以腺病毒為載體，受甲胎蛋白基因（alpha-fetoprotein，AFP）啟動子操控的目的蛋白可在肝癌細胞HepG2 中特異表達，而不表達于MCF-7 乳腺癌細胞。HepG2 分泌的CXCL10 可以有效趨化激活的T 細胞。初步體內試驗表明該實驗方案可以延緩腫瘤的生長速度。

PD-1/PD-L1 抗體是免疫治療的新手段，但有相當部分患者對其不響應。目前開發(fā)多種形式的聯(lián)合治療方案，提高PD-1 抗體的治療效果是研究熱點。PD-1/PD-L1 抗體是以調動T 細胞活性為基礎的抗腫瘤方法，研究表明腫瘤部位淋巴細胞的浸潤，是影響其治療效果的重要因素。筆者推測使腫瘤局部高表達恰當?shù)内吇蜃邮窃黾恿馨图毎櫟挠行Х绞剑?］。CXCL10/CXCR3 是CD8 陽性T 細胞遷移的信號軸，可募集激活狀態(tài)的細胞毒性T 細胞。本研究中，筆者于體外證明了T 細胞激活后CXCR3 表達上調，并可被感染腺病毒的HepG2 分泌的CXCL10 有效募集。

在基因轉移載體的選擇上，腺病毒載體是目前在腫瘤治療的臨床試驗中應用最多的載體，因其具有：宿主范圍廣，無致癌性，易于純化和濃縮，載體容量大等優(yōu)點。迄今，已知人腺病毒至少擁有近50 種血清型，大多數(shù)腺病毒載體都是基于血清型2 和血清型5。重組人Ad5 型腺病毒是我國唯一上市的病毒療法，已批準用于腫瘤的輔助治療，將其作為新冠病毒疫苗的臨床試驗也在開展當中。因此，在腫瘤的基因治療中，目前應用較多的腺病毒載體仍是首選。

在體內實驗中，可分泌PD-1 抗體及CXCL10 趨化因子的腺病毒并未產生預期的抑瘤效果。筆者推測有兩方面原因，一是瘤內注射的給藥方式限制了病毒的使用量，經多次預實驗表明50 μl 為瘤內注射劑量的上限，病毒劑量的不足可直接導致治療蛋白的分泌量不足。二是本實驗采用免疫缺陷鼠，并單獨給予活化的T 細胞，推測T 細胞能夠在趨化因子的作用下向腫瘤組織聚集，同時PD-1 抗體能夠阻斷免疫抑制信號，增強T 細胞的殺傷作用。但單獨給予的異種來源T 細胞與經過抗原提呈細胞活化的T 細胞有本質區(qū)別，不具備識別腫瘤抗原的能力，因而僅具有非特異殺傷作用。在后續(xù)實驗中筆者將采用人源化小鼠來解決腫瘤細胞異種移植帶來的免疫微環(huán)境缺失的問題?？傊?，本研究以腺病毒為載體，聯(lián)合PD-1 抗體和趨化因子，為腫瘤免疫治療提供了新的思路。