地鱉蟲活性蛋白分離純化及藥理學(xué)進(jìn)展

賈強(qiáng) 沈宏萍 仁德芳 曾海燕 袁紀(jì)元

摘要：地鱉蟲作為一種傳統(tǒng)的重要中藥材，在我國(guó)人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，從而地鱉蟲的來源豐富，價(jià)格便宜，從而廣泛的應(yīng)用于中藥處方中。隨著時(shí)代的進(jìn)步，其主要的活性成分纖溶蛋白質(zhì)、脂多糖等，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)了分離純化。針對(duì)地鱉蟲的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制等研究越來越多，并且成為熱點(diǎn)。目前已有大量研究證實(shí)地鱉蟲活性蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成及抗凝血等作用，本文就地鱉蟲活性蛋白的分離純化及藥理活性研究進(jìn)行簡(jiǎn)單的概述，為地鱉蟲的應(yīng)用前景進(jìn)行提供參考。

關(guān)鍵字：地鱉蟲;活性蛋白;抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成

【中圖分類號(hào)】R-3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）01-000-02

地鱉蟲Eupolyphage sinensisWalker，又名土元、土鱉，屬節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱蜚蠊日鱉蠊科動(dòng)物，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》及《金匱要略》等均對(duì)其有明確記載，該藥味咸，寒，具有逐瘀、破積、通絡(luò)、理傷等藥用功效，主治癥瘕（即腫塊、腫瘤）積聚、經(jīng)閉、瘀血、腹痛、跌打損傷等癥[1-3]。其中的活性蛋白成分由于其具有溶解靜脈血栓，抗氧化衰老、抗腫瘤等藥用功效成為了學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

1. 地鱉活性蛋白的分離純化

韓雅莉等人[4]將新鮮地鱉經(jīng)勻漿、鹽析和透析得到蛋白質(zhì)粗提物通過DEAE-52離子交換纖維素層析分離后洗脫出現(xiàn)了3中蛋白峰，選擇第3組蛋白含量較高的峰，并通過DS-PAGE電泳檢測(cè)，其電泳圖譜顯示出單一蛋白帶，最終純化最終提取到了蛋白質(zhì)的單一組分——纖溶活性蛋白（EFP）。EFP經(jīng)測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為41300，總含糖量為7.03%，經(jīng)IR分析后確定EFP為一種糖蛋白。

王鳳霞等人[5]，通過硫酸銨沉淀、超濾、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF 及 Q-Sepharose HP 離子交換、Butyl Sepharose HP 疏水色譜以及 Superdex 75 凝膠過濾色譜法分離純化得到單鏈蛋白活性組分EPS72，其分子質(zhì)量約為72 kD，對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞、肺癌 A549 細(xì)胞、宮頸癌 Hela 細(xì)胞、結(jié)腸癌 RKO 細(xì)胞以及胰腺癌 Panc-28 細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，提示該蛋白成分具有潛在的廣譜的抗癌活性。

王淑敏等人[6]，采用水提醇沉法提取地鱉蟲蛋白質(zhì)粗液，將其通過CM-Sepharose FastFlow離子交換柱層析的方法得到3個(gè)組分，其中組分Ⅲ的纖溶活性最高，經(jīng)透析、凍干后，呈淡黃色粉末，且易溶于水。

將組分III 經(jīng)Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，再得到3個(gè)組分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。組分Ⅵ活性最高，經(jīng)透析、凍干后，呈白色絮狀，易溶于水。經(jīng)反相高效液相色譜柱層析，收集保留時(shí)間為17 min左右。

2. 地鱉活性蛋白的抗腫瘤作用

曹付春等人[7]，研究了EFP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人肺癌（A 549）、乳腺癌（MCF- 7）細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），發(fā)現(xiàn)EFP含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、肺癌、乳腺癌細(xì)胞的VEGF和bFGF表達(dá)均有抑制作用，提示EFP可抑制腫瘤細(xì)胞VEGF和bFGF表達(dá)。而惡性腫瘤生長(zhǎng)可分為無血管的緩慢生長(zhǎng)階段與有血管的快速增殖階段，若無血管生成，則原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)緩慢，從而提示EFP通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少有關(guān)促血管生長(zhǎng)因子VEGF、bFGF等蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成。

林澤飛等人[8]，將不同濃度 EFP 小鼠含藥血清，對(duì) A549 細(xì)胞做了增殖抑制效果考察，采用 MTT 法、流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V - FITC/PI 雙熒光染色法以及免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證 EFP 對(duì)A549 細(xì)胞做了增殖作用，發(fā)現(xiàn)隨著 EFP 劑量的增大，A549 細(xì)胞凋亡數(shù)增加，其中高濃度和中濃度的凋亡率接近;EFP 能夠延緩 G0 /G1 期向 S 期過渡，改變細(xì)胞的周期分布，使細(xì)胞阻滯于 G0 /G1 期，抑制 A549 細(xì)胞的增殖活性;EFP 含藥血清組的Bcl-2陽性率降低，Bax 陽性率升高，提示EFP 可增強(qiáng)肺癌 A549 細(xì)胞 bax 的表達(dá)，抑制 Bcl - 2 的表達(dá)，從而抑制其生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過下調(diào) Bcl-2 蛋白表達(dá)和上調(diào) Bax 蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

劉浩等人[9]建立了S180腹水瘤、實(shí)體瘤模型以及H22荷瘤腹水瘤、實(shí)體瘤模型。將S180腹水瘤小鼠、S180實(shí)體瘤小鼠、H22腹水瘤小鼠以及H22實(shí)體瘤小鼠分別40只，每個(gè)類別隨機(jī)分5組（8只/組），陽性對(duì)照組（注射環(huán)磷酰胺），陰性對(duì)照（注射生理鹽水），藥物高劑量組，中劑量組，低劑量組，將40只以及40只，分別隨機(jī)分5組（8只/組），陽性對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EFP濃度2.90mg·kg- 1對(duì)S180腹水瘤、2.18mg·kg- 1對(duì)H22肝癌和0.73～ 1.45mg·kg- 1對(duì)S180實(shí)體瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用。在高濃度的EFP對(duì)小鼠的S180實(shí)體瘤抑瘤率與環(huán)磷酰胺相似，在低濃度EFP對(duì)H22實(shí)體瘤抑瘤率最高，且高濃度下小鼠脾重最大。提示，地鱉蛋白對(duì)S180和H22腫瘤細(xì)胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和環(huán)磷酰胺類似。且EFP對(duì)S180等細(xì)胞無殺傷效果，說明EFP對(duì)S180、H22荷瘤小鼠存在顯著抑瘤作用，而無明顯的細(xì)胞毒作用。

3. 地鱉活性蛋白抗氧化衰老作用

谷崇高等人[10]，通過小鼠連續(xù)腹腔注射D-半乳糖 20 d，建立了小鼠衰老模型，對(duì)模型小鼠每日灌服 0、40、80、160 mg / kg地鱉多肽提取物，衰老組以及對(duì)照組小鼠每天灌服等量生理鹽水，觀察小鼠的正?；顒?dòng)、運(yùn)動(dòng)和耐應(yīng)激能力。分別采用黃嘌呤氧化酶法、分光光度法檢測(cè)小鼠血液和不同組織中超氧化物歧化酶（ SOD） 、過氧化氫酶（ CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-PX） 活力，以及丙二醛（ MDA） 和還原型谷胱甘肽（ GSH）含量，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子 2（ Nrf2） 在 Caco-2 細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照和多肽組比較，衰老組小鼠體重增重緩慢、組織臟器系數(shù)降低、運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短、抗應(yīng)激能力降低、組織中抗氧化酶活力降低。多肽組小鼠體重增加明顯，肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)增加顯著，小鼠靜力和動(dòng)力運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，并與地鱉多肽劑量的呈正比關(guān)系。與對(duì)照組比較，劑量組小鼠耐缺氧、耐高溫和運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)并與之接近，血液和不同組織中的 SOD、CAT、GSH-PX 活力及 GSH 含量顯著提高，但MDA 含量降低，Caco-2 細(xì)胞核內(nèi) Nrf2 表達(dá)量明顯增加，接近陽性對(duì)照組。由此可知，地鱉多肽可能通過啟動(dòng) Nrf2-ARE 抗氧化信號(hào)通路，提高 D-半乳糖致衰老小鼠抗應(yīng)激和抗氧化能力，從而延緩小鼠氧化衰老。

4. 結(jié)語：

綜上所述，地鱉活性蛋白具有良好的藥理活性，特別是在抗腫瘤方面，有較好的開發(fā)潛力。

參考文獻(xiàn)：

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通訊作者：

袁紀(jì)元（1992-），女，西南醫(yī)科大學(xué)碩士，研究方向?yàn)椋盒滦退幬镞f送系統(tǒng)設(shè)計(jì)與系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

作者簡(jiǎn)介：

賈強(qiáng)（1992-），男，西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)士，研究方向?yàn)椋盒滦退幬镞f送系統(tǒng)設(shè)計(jì)與系統(tǒng)評(píng)價(jià);

沈宏萍高級(jí)職稱 研究方向：藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)管理與臨床藥理

仁德芳（1991-），女，西南醫(yī)科大學(xué)碩士，研究方向?yàn)椋盒滤幣R床。

曾海燕（1986-），女，碩士，研究方向?yàn)椋毫餍胁W(xué)。

基金項(xiàng)目：2018年度西南醫(yī)科大學(xué)校級(jí)基金資助項(xiàng)目 西南醫(yī)大?！?018】138號(hào)

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