基于ISSR分子標記的葉子花親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建

孫利娜 李進華 甘四明 唐慶 李冰 劉雁玲 馬堅煒 廖美蘭 黃欣 林茂

摘要：為分析品種遺傳多樣性和遺傳距離并構(gòu)建品種聚類圖和指紋圖譜，該研究從DNA模板濃度、引物濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等方面優(yōu)化了葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，利用11個ISSR引物對131個葉子花品種進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明：優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系中DNA模板濃度為0.5 ng·μL1，引物濃度為0.5 μmol·L1，引物UBC813、UBC814、UBC815、UBC823、UBC824、UBC835、UBC840、UBC841、UBC843、UBC844和UBC876的最佳退火溫度分別為52.3、55.9、54.3、54.3、53.6、56.2、56.2、51.9、54.4、54、50 ℃，循環(huán)次數(shù)為32。用11個ISSR引物對131個葉子花品種擴增出161條帶，其中多態(tài)性條帶156條，多態(tài)性比率為96.89%。單個引物的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)分別為1.86～2.00、1.33～1.68、0.21～0.39和0.34～0.57，平均值分別為1.969、1.478、0.294和0.447。引物UBC841的鑒別率最高（80.92%），可有效鑒別106個品種，與引物UBC876結(jié)合可將131個葉子花品種完全鑒別開，建立了各品種的指紋圖譜。葉子花品種的遺傳距離范圍為0.00～0.60，平均值為0.365，遺傳多樣性較低，在遺傳距離0.58處，131個品種分為6大類群，聚類分析顯示同一個種的品種大多聚在一類，但同一個種仍有品種未聚在一類或亞類、也有多個種的品種聚在一類。該研究較為準確地揭示了葉子花種質(zhì)資源的遺傳多樣性，建立的指紋圖譜為葉子花品種登記、知識產(chǎn)權(quán)保護以及品種鑒定提供了可靠技術(shù)和有效手段。

關(guān)鍵詞： 葉子花， ISSR標記， 遺傳多樣性， 親緣關(guān)系， 指紋圖譜

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2021）02025115

Abstract：In this study， ISSRPCR reaction system was optimized from DNA template concentration， primer concentration， annealing temperature and cycle times， a total of 11 ISSR markers were used to amplify DNA samples of the 131 Bougainvillea cultivars， and the ISSR amplicons were detected based on a agarose gel electrophoresis method. Cultivars genetic diversity was analysed， their genetic distances were calculated， and the clustering analysis and fingerprint construction were performed for all the cultivars. The results were as follows： DNA template concentration was 0.5 ng·μL1， primer concentration was 0.5 μmol·L1， and the optimal annealing temperature of primers UBC813， UBC814， UBC815， UBC823， UBC824， UBC835， UBC840， UBC841， UBC843， UBC844 and UBC876 were 52.3， 55.9， 54.3， 54.3， 53.6， 56.2， 51.9， 54.4， 54， 50 ℃， respectively， the number of rings was 32. A total of161 bands were generated collectively by the 11 ISSR primers， and the 156 bands were polymorphic， and the polymorphic ratio was 96.89%. Allele number， effective allele number， Neis gene diversity index and Shannons information index ranged from 1.86 to 2.00， 1.33 to 1.68， 0.21 to 0.39 and 0.34 to 0.57， with an average of 1.969， 1.478， 0.294 and 0.447 per primer， respectively. Primer UBC841 had the highest identification rate（80.92%）， by which 106 cultivars were identified. A total of 131 cultivars were completely identified and their molecular fingerprints were constructed based on combination of UBC841 and UBC876. The genetic distance between 131 cultivars ranged from 0.00 to 0.60， with an average value of 0.365， and genetic diversity of 131 Bougainvillea cultivars was low， which were divided into six groups at 0.58 genetic distance. Clustering analysis indicates that majority of the cultivars within a species tend to fall in the same cluster， but some cultivars of the same species were grouped in different clusters or subclusters and certain cultivars from different species grouped in the same cluster. Genetic diversity of Bougainvillea germplasm resources was revealed accurately， the ISSRbased fingerprints of Bougainvillea cultivar provide reliable technique for cultivar registration and intellectual property protection as well as cultivar clarification in production practices.

Key words： Bougainvillea， ISSR marker， genitic diversity， genetic relationship， fingerprints

葉子花（Bougainvillea spectabilis）屬于瑞香目（Thymelaeceae）紫茉莉科（Nyctaginaceae）葉子花屬（Bougainvillea）植物，在熱帶和亞熱帶地區(qū)常用于園林綠化，在我國的栽培歷史有100多年。葉子花品種繁多，芽變類型豐富，我國引種選育的大約有200個品種，但它們的遺傳關(guān)系不明確，并且存在同物異名和同名異物現(xiàn)象。目前，關(guān)于葉子花的研究多集中在繁殖栽培（周群，2008;Moneruzzaman et al.，2010;孫利娜等，2017a）和理化研究方面（趙家昱等，2014;Figueroa et al.，2014;Marana et al.，2015;Chauhan et al.，2016），關(guān)于遺傳多樣性方面的研究不多，尤其是基于內(nèi)部簡單重復(fù)序列（InterSimple Sequence Repeats， ISSR）分子標記技術(shù)分析葉子花種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究，目前研究較少，并且分析的品種數(shù)量較少（李房英等，2011）。利用ISSR分子標記鑒定大批量葉子花品種、構(gòu)建葉子花品種指紋圖譜的研究還未見報道。

ISSR分子標記技術(shù)是在簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSR）標記基礎(chǔ)上建立起來的，在簡單重復(fù)序列的一端加1～4個堿基設(shè)計引物，檢測兩個距離較近、方向相反的SSR之間的DNA序列多態(tài)性，原理與SSR相似（周蘭英，2014;邵珠田，2017）。ISSR標記引物設(shè)計簡單，多態(tài)性高于隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA， RAPD）和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism， RFLP），易操作，所需DNA少，穩(wěn)定性強，重復(fù)性好，成本低且安全性高（譚華強，2014）。目前，ISSR標記已廣泛應(yīng)用到親緣關(guān)系分析（李國帥，2014）、遺傳多樣性分析（王琳，2015;梁穎，2018）、指紋圖譜構(gòu)建（王璐靜，2016）、品種鑒別（Ali，2015;孫利娜等，2017b;Jedrzejczyk et al.，2018）、純度鑒定（管潔等，2013）、遺傳穩(wěn)定性分析（Reza et al.，2018）等領(lǐng)域。本研究以131個葉子花品種為研究對象，利用ISSR標記分析它們的遺傳多樣性，確定它們的親緣關(guān)系，并進行品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建，從而為葉子花種質(zhì)資源保存、知識產(chǎn)權(quán)保護以及品種鑒定提供了可靠技術(shù)和有效手段。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料參試的131個葉子花品種見表1，其中18個品種（序號1-18）保存于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院園林花卉所，113個品種（序號19-131）采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品質(zhì)資源研究所。從生長健壯、無病蟲害的植株上采集幼嫩葉片，迅速提取DNA，冷凍于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 引物的合成與篩選引物序列來自加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個ISSR引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，從中篩選出多態(tài)性高，穩(wěn)定性強，重復(fù)性好的引物用于葉子花品種的親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 葉子花基因組DNA提取與檢測采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取幼嫩葉片的DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計檢測DNA濃度。

1.2.2 葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化參考李房英等（2010），將該實驗的原初擴增反應(yīng)體系定為20 μL，包括：2× Drem Taq mix 10 μL、ISSR Primer（10 umol·L1）1 μL、RNasefree water 8 μL、20～30 ng Template g DNA 1 μL。然后，對影響DNA擴增的重要因素如模板DNA濃度（模板DNA為橙紅品種（Bougainvillea spectabilis ‘Auratus）和所用引物濃度設(shè)置梯度，模板DNA設(shè)400、200、50、20、10、5、0.2 ng·μL1共7個濃度，引物設(shè)40、20、15、10、4、2 pmol·μL1 共6個濃度，利用初篩獲得的擴增效果較好的引物UBC815進行最優(yōu)條件的篩選，以期獲得最佳反應(yīng)體系。

PCR擴增反應(yīng)在深圳珠海黑馬公司生產(chǎn)的HeMa9600基因擴增儀上進行，PCR最初擴增程序：94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，38個循環(huán)后4 ℃保存。在此基礎(chǔ)上，對篩選出的11個引物設(shè)置退火溫度試驗、對循環(huán)數(shù)進行梯度設(shè)置（20個循環(huán)、23個循環(huán)、26個循環(huán)、29個循環(huán)、32個循環(huán)、35個循環(huán)、38個循環(huán)、42個循環(huán)）。

PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖膠檢測，Goldview 染色，在電壓不超過5 V·cm1 的電場強度下，1×TAE 緩沖液中電泳90 min，JS1075凝膠成像系統(tǒng)上觀察成像。

1.2.3 ISSRPCR反應(yīng)體系驗證以供試的其中任意18個葉子花品種的DNA為模版，用篩選出的多態(tài)性好的ISSR引物在最佳反應(yīng)體系及擴增程序下進行PCR擴增，檢驗反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

1.2.4 葉子花種質(zhì)資源ISSR擴增數(shù)據(jù)處理與分析對擴增產(chǎn)物進行人工讀帶，以片段大小為5 000 bp的Marker為標準，統(tǒng)計重復(fù)性好、清晰明亮的條帶，有條帶出現(xiàn)的位點記為 “1”，無條帶出現(xiàn)或模糊不清的位點記為“0”。將讀取的條帶信息轉(zhuǎn)化為0、1數(shù)據(jù)矩陣，利用PopGene32軟件對供試材料的多態(tài)性位點百分率（percentage of polymorphic loci， PPL）、觀測等位基因數(shù)（observation of allele number， Na）、有效等位基因數(shù)（number of effective alleles， Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（gene diversity index， H）、Shannons信息指數(shù)（Shannons information index， I）、遺傳距離（genetic distance， GD）及遺傳相似系數(shù)（coefficient of genetic similarity， GS）等遺傳參數(shù)進行分析，并基于遺傳距離和遺傳相似系數(shù)在軟件NTSYSpc 2.1（Rohlf et al.， 2000）中采用非加權(quán)分組算術(shù)平均（unweighted pair group method with Arithmetic Mean，UPGMA）法對品種聚類分析，建立葉子花品種的DNA數(shù)字指紋圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

利用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒提取的葉子花基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰、明亮、無拖尾、樣孔內(nèi)無雜質(zhì)。圖1顯示了20個樣品DNA的電泳檢測結(jié)果。利用紫外分光光度計測定所提DNA樣品的OD260/OD280值，結(jié)果OD260/OD280值都在1.8～2.0之間，濃度在200～400 ng·μL1。以上結(jié)果說明本研究采用的DNA提取法提取的葉子花DNA效果好，可用于后續(xù)試驗。

2.2 葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 DNA模板對PCR反應(yīng)的影響DNA模板濃度和質(zhì)量是影響ISSRPCR擴增效果的重要因素，本實驗利用引物UBC815擴增DNA模板，擴增產(chǎn)物（圖2）表明：模板濃度在0.01～50 ng· μL1 范圍內(nèi)均能擴增出條帶，但在0.01 ng· μL1、0.05 ng· μL1、10 ng· μL1、50 ng·μL1濃度下擴增的效果較差，0.1～2 ng·μL1濃度范圍內(nèi)差異不明顯。經(jīng)多次重復(fù)試驗，在0.5 ng·μL1濃度時條帶較清晰、穩(wěn)定。

2.2.2 引物濃度對PCR反應(yīng)的影響引物濃度在0.1～2.0 μmol·L1范圍內(nèi)均能擴增出條帶，但在0.1 μmol·L1、0.2 μmol·L1和2.0 μmol·L1濃度下擴增的條帶較少、亮度低，濃度在0.5～1.0 μmol·L1時擴增效果較好，經(jīng)反復(fù)試驗，最終確定后續(xù)試驗所用引物濃度為0.5 μmol·L1，如圖3所示。

2.2.3 退火溫度對PCR反應(yīng)的影響本研究在最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上對篩選出的11個引物進行退火試驗，確定了每個引物的最佳退火溫度，引物UBC813、UBC814、UBC815、UBC823、UBC824、UBC835、UBC840、UBC841、UBC843、UBC844和UBC876的最佳退火溫度分別為52.3、55.9、54.3、54.3、53.6、56.2、56.2、51.9、54.4、54、50 ℃。部分引物篩選退火溫度電泳圖如圖4、圖5和圖6所示。

2.2.4 循環(huán)次數(shù)對PCR反應(yīng)的影響增加循環(huán)數(shù)在一定程度上能夠提高產(chǎn)物量，但反應(yīng)時間過長會使非特異擴增產(chǎn)物增加，而且會受到各反應(yīng)成分的用量限制，如：隨著酶的擴增能力下降，合成目標片段的能力也隨之下降，因此，適宜的循環(huán)次數(shù)對于擴增效果至關(guān)重要。

不同循環(huán)次數(shù)下的 ISSRPCR擴增結(jié)果如圖7所示，模板在20～26個循環(huán)時均未擴增出條帶，29～41個循環(huán)時均能擴增出條帶，但在32個循環(huán)時可獲得明亮清晰的條帶，效果最好，如果再增加循環(huán)次數(shù)，條帶變化不大，但從節(jié)約時間和成本考慮，以32個循環(huán)為宜。

2.3 ISSRPCR體系穩(wěn)定性檢測

從毛葉葉子花（Bougainvillea spectabilis）品種、光葉葉子花（B. glabra）品種、巴特葉子花（Bougainvillea × buttiana）品種、秘魯葉子花（B. peruviana）品種和拉丁名不詳?shù)钠贩N（Bougainvillea sp.）中選出18個樣品用于檢測優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系，用引物UBC824對其進行擴增（圖8），擴增結(jié)果顯示本研究優(yōu)化的葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，條帶清晰、重復(fù)性和多態(tài)性高，有豐富的特異性，可用于后續(xù)研究。

2.4 ISSR引物篩選

本文對100個ISSR引物進行初篩、復(fù)篩，并確定最終篩選出的引物最佳退火溫度，共篩選出11個擴增條帶多、條帶清晰、重復(fù)性好的ISSR引物，部分引物篩選結(jié)果如圖9、圖10所示。

2.5 葉子花種質(zhì)資源ISSR分析

2.5.1 ISSR引物多態(tài)性分析從100個ISSR引物中篩選出11個擴增條帶多、條帶清晰、多態(tài)性高和重復(fù)性好的引物，對131個葉子花品種進行分析，結(jié)果見表3。11個引物共擴增161條帶，平均每個引物擴增14.6條，其中有156條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為96.89%。11個引物的擴增條帶數(shù)在12～20之間，擴增條帶數(shù)最多的是UBC841（20條），UBC814、UBC815和UBC843擴增的條帶最少，均為12條。除引物UBC823、UBC835和UBC840之外，其余引物產(chǎn)生的多態(tài)性比例都達到100%，說明這11條引物在供試材料中的多態(tài)性較好。引物UBC815對部分樣品擴增的電泳圖如圖11所示。

2.5.2 葉子花種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析將讀取的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0、1矩陣，利用Popgene32軟件分析相關(guān)遺傳參數(shù)，分析結(jié)果見表4。單個引物的等位基因數(shù)為1.86～2.00，平均等位基因數(shù)1.969;有效等位基因數(shù)為1.33（UBC840）～1.68（UBC876），平均有效等位基因數(shù)為1.478;Neis基因多樣性指數(shù)為0.21（UBC840）～0.39（UBC841），平均值為0.294;Shannons信息指數(shù)為0.34（UBC823、UBC840）～0.57（UBC841），平均值為0.447。從4個遺傳參數(shù)看，引物UBC841和UBC876的各項值均較其他引物高，引物UBC840的有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)均為最低。由以上結(jié)果可知，葉子花的遺傳多樣性不夠豐富。

2.5.3 葉子花種質(zhì)資源的UPGMA聚類分析基于11個ISSR引物計算的葉子花131個品種間的遺傳距離范圍為0.00～0.60，平均值為0.365，利用UPGMA法對131個葉子花品種聚類分析，建立聚類分析樹狀圖（圖12），從聚類圖可以看出，在遺傳距離0.58處，131個品種分為6大類群，即類群1、類群2、類群3、類群4、類群5和類群6。

類群1包含4個種的25個品種，其中13個光葉葉子花、4個毛葉葉子花、1個巴特葉子花、1個秘魯葉子花、6個拉丁名不詳?shù)钠贩N。在遺傳距離0.54處，類群1可再分為3個亞群，分別為亞群1-Ⅰ、亞群1-Ⅱ和亞群1-Ⅲ。亞群1-Ⅰ包括8個光葉葉子花品種（1號、3號、7號、19號、20號、21號、38號和39號）、2個毛葉葉子花品種（9號和11號）、3個拉丁名不詳?shù)钠贩N（126號、101號和127號）;亞群1-Ⅱ包括3個光葉葉子花品種（37號、40號和41號）、2個毛葉葉子花品種（40號和84號）、1個巴特葉子花品種（51號）、1個秘魯葉子花品種（76號）、3個拉丁名不詳?shù)钠贩N（92號、130號和131號）;亞群1-Ⅲ僅包括2個光葉葉子花品種（2號和4號）。

類群2共包含9個品種，其中5個光葉葉子花品種（25號、26號、27號、29號和28號）、1個巴特葉子花品種（45號）、3個拉丁名不詳?shù)钠贩N（110號、112號和111號）。類群3共包含86個品種，其中6個光葉葉子花品種、29個巴特葉子花品種、6個毛葉葉子花品種、9個秘魯葉子花品種、2個光葉×毛葉雜交種（B. × spectoglabra）和33個拉丁名不詳?shù)钠贩N。在遺傳距離0.56處，類群3可再分為4個亞群，分別為亞群3Ⅰ、亞群3Ⅱ、亞群3Ⅲ和亞群3Ⅳ。亞群3Ⅰ包括2個光葉葉子花品種（5號和6號）、5個巴特葉子花品種（18號、17號、14號、15號和16號）、2個毛葉葉子花品種（8號和10號）、2個光葉×毛葉雜交種（13號和12號）。亞群3Ⅱ僅有1個拉丁名不詳?shù)钠贩N（86號）。在遺傳距離0.53處，亞群3Ⅲ又可分為3ⅢA、3ⅢB、3ⅢC、3ⅢD、3ⅢE、3ⅢF和3ⅢG七個小類，其中：3ⅢA小類包括1個光葉葉子花品種（31號）、2個毛葉葉子花品種（81號和80號）、1個巴特葉子花品種（56號）、8個拉丁名不詳?shù)钠贩N（97號、118號、119號、120號、116號、96號、95號和115號）;3ⅢB小類包括1個光葉葉子花品種（36號）、1個毛葉葉子花品種（82號）、4個巴特葉子花品種（58號、59號、60號和53號）、3個秘魯葉子花品種（71號、72號和75號）、5個拉丁名不詳?shù)钠贩N（98號、99號、125號、113號和122號）;3ⅢC小類包括1個光葉葉子花品種（23號）、10個巴特葉子花品種（47號、49號、50號、42號、43號、48號、55號、57號、44號和46號）、3個秘魯葉子花品種（74號、69號和70號）、10個拉丁名不詳?shù)钠贩N（104號、102號、106號、85號、88號、114號、121號、91號、108號和107號）;3ⅢD小類包括7個巴特葉子花品種（61號、62號、63號、67號、64號、65號和66號）、1個秘魯葉子花品種（77號）、3個拉丁名不詳?shù)钠贩N（128號、129號和109號）;3ⅢE小類包括1個秘魯葉子花品種（73號）和1個毛葉葉子花品種（78號）;3ⅢF小類包括2個拉丁名不詳?shù)钠贩N（89號和90號）;3ⅢG小類包括1個巴特葉子花品種（54號）和3個拉丁2個拉丁名不詳?shù)钠贩N（87號和105號）。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，131個品種均被聚類分開，說明供試品種之間具有一定的遺傳差異，ISSR標記在葉子花種質(zhì)資源分析和品種鑒定研究方面具有較好的效果。

2.5.4 葉子花種質(zhì)資源的指紋圖譜構(gòu)建利用篩選出的11個ISSR引物對131個葉子花品種擴增，可將131個樣品完全區(qū)分開，對電泳條帶進行統(tǒng)計，在同一位點處，有條帶出現(xiàn)的標記為“1”，無條帶出現(xiàn)的標記為“0”，用0/1數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建131個葉子花品種的指紋圖譜（表5），11個引物中引物UBC841的鑒別率最高（80.92%），可有效鑒別106個品種，再與引物UBC876結(jié)合可將131個葉子花品種完全鑒別開。引物UBC841共擴增出20個多態(tài)性位點，分別是2 500、2 200、2 000、1 600、1 500、1 450、1 100、1 000、950、850、750、700、650、550、450、400、350、150、250、2 900 bp。引物UBC876共擴增出15個多態(tài)性位點，分別是2 800、2 500、2 000、1 800、1 500、1 350、1 150、1 050、900、850、750、650、550、3 100、500 bp。

3討論與結(jié)論

3.1 ISSR體系優(yōu)化

DNA模板量對PCR擴增起著關(guān)鍵作用，本研究DNA模板濃度在0.01～50 ng·μL1范圍內(nèi)均能擴增出條帶，但濃度過高或過低擴增的條帶不清晰、彌散（王渭霞等，2010），經(jīng)反復(fù)試驗，確定0.5 ng·μL1為最佳濃度，此濃度下擴增的條帶最清晰、穩(wěn)定。引物濃度直接影響PCR擴增結(jié)果，過高會增加錯配和非特異性擴增的幾率，且易使引物之間形成二聚體，濃度過低易導(dǎo)致擴增產(chǎn)物不足，影響擴增效果（劉昕，2014）。PCR特異性亦受退火溫度的影響，而堿基組成及其濃度、引物長度和靶基序列長度都影響退火溫度，因此不同的引物其退火溫度不一樣（張茹，2014），本研究通過梯度試驗，篩選出每個引物的最適退火溫度。循環(huán)次數(shù)對PCR擴增具有決定性的影響，循環(huán)次數(shù)越多，產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的量也越多，一般控制在30～40次之間（馮富娟等，2004），本研究在32個循環(huán)時可獲得明亮清晰的條帶，效果最好。

3.2 ISSR標記分析葉子花種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系

本研究在優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，基于11個多態(tài)性高、重復(fù)性好和穩(wěn)定性強的ISSR引物對131個葉子花品種進行擴增，共擴增出161條帶，其中有156條譜帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為96.7%，較RAPD（多態(tài)性比率67.4%）（Richa et al.，2009）和同工酶（多態(tài)性比率75.5%）具有更為豐富的多態(tài)性（尹俊梅等，2001）。供試的葉子花Neis基因多樣性指數(shù)（均值0.29）和Shannons信息指數(shù)（均值0.45）都較低，并且遺傳相似系數(shù)高（0.64～0.95），這些數(shù)據(jù)均表明供試品種的遺傳多樣性不高，這一結(jié)果同黃彥晶（2010）（68份葉子花的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.97）和Richa et al.（2009）（30份葉子花的遺傳相似系數(shù)為0.51～0.94）的研究結(jié)果相一致。葉子花遺傳多樣性不高的原因可能是葉子花特殊的花器官構(gòu)造以及花粉活力低使其雜交育種受到限制，導(dǎo)致無性繁殖成其主要繁殖方式，而長期的無性繁殖使得葉子花的基因池變窄，遺傳相似性較高，親緣關(guān)系較近（黃彥晶，2010）。

供試葉子花品種間的遺傳距離為0.00～0.60，平均0.365，聚類分析中131個葉子花品種均可有效鑒定，表明ISSR對葉子花品種鑒定具有較高的可靠性。通過聚類，在遺傳距離0.58處，將所有葉子花品種聚為6大類，說明供試品種間存在差異，并且聚類呈現(xiàn)一定規(guī)律，如：每個種的大部分品種聚在一類，如光葉葉子花30個品種中18個（60.0%）聚在類群1和類群2（類群1和類群2屬于一大類，二者在遺傳距離0.56處被分成兩個類群），巴特葉子花31個品種中29個（93.5%）聚在類群3，秘魯葉子花11個品種中9個（81.8%）聚在類群3，2個雜交種12號和13號聚在亞群3Ⅰ。但是，同一個種仍有品種未聚在一類或亞類，如光葉葉子花品種綠葉淺紫和雪紫分別聚在類群4和類群5，白雪公主、小葉紫、新加坡白和新加坡粉聚在類群6，與其主要聚類的類群1和類群2分開聚類;1個巴特葉子花品種（金邊葉重粉）聚在了類群1，而巴特葉子花是光葉葉子花和秘魯葉子花的雜交種，該品種在擴增中表現(xiàn)出光葉葉子花品種的特征，所以和光葉葉子花品種聚在一起。此外，也有多個種的品種聚在一類，如類群3包含了所有的種和雜種，可能原因是這些品種長期生活在相似的環(huán)境下使其很多習(xí)性、性狀乃至控制表型的基因逐漸趨于一致。

與李房英等（2011）基于ISSR的68個品種的聚類結(jié)果比較，品種名相同的16個品種聚類關(guān)系相似，如光葉斑葉紫花、大花深紫、黃金葉和胭脂紅聚在亞群1Ⅰ（李房英等的品種依次為光葉斑葉紫花、黃金葉、小葉紫花和青葉白，聚為A類），皺葉深紅、櫻花、水紅、塔紫、金心和斑葉塔紫聚在亞群3Ⅰ（李房英等的品種依次為皺葉深紅、塔橙、重瓣白里透紅、塔紫、金心寶巾和斑葉塔紫，聚為B類）。但是，基于ISSR分子標記的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的依據(jù)形態(tài)分類的結(jié)果并不嚴格一致，如30號綠葉淺紫屬于光葉葉子花，79號毛葉屬于毛葉葉子花，二者形態(tài)差異明顯，并且分別屬于不同的種，而在此聚類中二者卻被聚為一類，表明分子標記檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的表型分類仍存在一定差別。

通過本研究，一方面確定了葉子花品種間的親緣關(guān)系，另一方面成功地建立了葉子花的分子指紋，為今后葉子花種質(zhì)資源保存和品種鑒定提供了有用的信息。

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（責(zé)任編輯李莉）