牡丹籽蛋白提取工藝及其多肽應(yīng)用研究進展

◎ 陳 容，胡素素，鄭淳堅，柯德森

（廣州大學 生命科學學院，廣東 廣州 510006）

牡 丹（Paeonia suffruticosaAndr.）為 芍 藥 科、芍藥屬植物，為中國國花，其分為觀賞型牡丹與油用型牡丹，油用牡丹在提油過程中籽粕的產(chǎn)出率為25%～30%，我國每年產(chǎn)生高達5萬t的牡丹籽殼和餅粕[1]，大多被用作蛋白飼料或丟棄。牡丹籽粕含多種營養(yǎng)成分，粗蛋白含量高達28.12%，包含8種必需氨基酸，此外還含有黃酮、多糖等物質(zhì)[2]。牡丹籽蛋白具有較好的起泡性、持水性、乳化性與乳化穩(wěn)定性[3]，此外，牡丹籽多肽還具有抗氧化、抗菌、降血壓、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等生物活性，開發(fā)利用前景廣闊。

本文概述了牡丹籽蛋白的制備方法及其多肽的功能特性，為牡丹籽蛋白的進一步開發(fā)利用提供參考，充分開發(fā)利用牡丹籽粕資源，提高牡丹種植的附加值。

1 牡丹籽蛋白提取工藝

1.1 反膠束萃取法

反膠束是表面活性劑溶于有機溶劑后自發(fā)形成的一種納米聚集體，能夠?qū)⒕哂杏H水性的生物大分子溶解其中，以膠束的形式萃取出來[4-5]。目前較多研究者使用該方法分離油脂與蛋白質(zhì)達到分離純化蛋白質(zhì)的目的，但將此方法用于提取牡丹籽蛋白的研究較不常見。

昝麗霞等[6]通過實驗與響應(yīng)面分析優(yōu)化了反膠束萃取法在不同物理輔助法下的工藝條件，微波輔助法：時間10.20 min、微波溫度47.66 ℃、微波功率400 W，此條件下牡丹籽蛋白萃取率為48.22%；超聲輔助法：超聲時間60 min、超聲溫度30 ℃、料液比1∶50，此條件下牡丹籽蛋白萃取率為84.33%，超聲輔助萃取率高于微波輔助萃取。

反膠束萃取法的條件溫和，具有萃取效率高、操作簡單、蛋白質(zhì)不易失活、溶劑可以循環(huán)利用及成本較低等優(yōu)點。缺點是使用溶劑較多，表面活性劑可能存留于產(chǎn)品中，且不利于提取相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)[7-8]。

1.2 堿溶酸沉法

堿溶酸沉法是牡丹蛋白目前較為普遍與傳統(tǒng)的提取方法，其利用物料中不同組分具有的酸堿性差異將它們進行分離。調(diào)節(jié)溶液的pH值到蛋白的等電點時，蛋白就會沉淀，從而達到分離蛋白的目的[9]。徐玥等[10]通過實驗優(yōu)化堿提酸沉法提取牡丹籽蛋白的最佳工藝條件為料液比1∶12、堿液pH=8.5、提取時間60 min、提取溫45 ℃，在此條件下牡丹籽蛋白提取率為（78.23±0.04）%；牡丹籽蛋白最佳酸沉條件為pH=4.0，此時蛋白沉淀率達（90.90±0.11）%。王敏等[11]發(fā)現(xiàn)采用堿溶酸沉法提取的牡丹籽蛋白在中性條件擁有比米糠蛋白更高的溶解度。

堿提酸沉法存在耗酸耗堿量較大、易造成環(huán)境污染、蛋白質(zhì)變性及所提蛋白純度不高等不足[12]。近年來由于超聲波技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，較多研究者開始嘗試采用超聲輔助堿提取方法來提取籽粕中的蛋白質(zhì)。超聲波所具有的機械粉碎和空化作用能夠使溶劑以更大的速度滲透入原料細胞內(nèi)[13]，單位時間內(nèi)擁有更大的滲透率，從而縮短蛋白質(zhì)提取時間，提高提取率。劉柏華等[12]發(fā)現(xiàn)相比于常規(guī)堿提取，用超聲輔助堿提取法提取牡丹籽蛋白，提取率高出7.17%，純度提高14.49%，堿液消耗減少1/3，各種氨基酸的含量也有一定提高，總含量達95.049 mg/100 g。王青等[14]通過超聲波輔助堿提法提取牡丹籽蛋白，得出蛋白質(zhì)提取率影響因素的影響程度依次是：溶液pH＞提取時間＞提取溫度＞料液比。優(yōu)化后的蛋白質(zhì)提取工藝為提取溫度47 ℃、料液比1︰35 g·mL-1、提取時間150 min、pH=11.5，所得蛋白質(zhì)提取率為93.12%。

除超聲波輔助等物理輔助法外，龐雪風等[15]還嘗試采用了糖化酶輔助堿溶酸沉法提取了牡丹籽蛋白，提取率為88.34%。

1.3 鹽溶法

低鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水部位或基團在水中形成水膜，阻礙分子間相互接觸。中性鹽加入后與蛋白質(zhì)爭奪水分子、破壞水膜，使蛋白質(zhì)分子在疏水鍵作用下聚沉。NaCl溶液能使蛋白質(zhì)保持自身特性與功能，避免變性[9]。堿溶法的提取率高于鹽溶法，但鹽溶法提取的蛋白具有更佳的色澤[16]。

李強等[17]優(yōu)化得到鹽溶法最佳提取工藝為：提取時間69 min，提取溫度為40 ℃，料液比為1︰20，NaCl濃度為1.03 mol·L-1，蛋白提取率為23.49%，蛋白有效提取出78.30%。

1.4 酶解法

酶解法提取是利用酶的專一性，與牡丹籽粕的特定物質(zhì)相互作用得出多肽。其分為蛋白酶法與非蛋白酶法，常用的蛋白酶有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等，其中堿性蛋白酶的酶解效果最好。非蛋白酶法是將牡丹籽粕中的纖維素、淀粉等非蛋白質(zhì)成分水解，使蛋白質(zhì)的提取及其與蛋白酶的相互作用更加容易[18]。

喬慧茹等[19]用6種蛋白酶對牡丹籽粕進行水解，其中采用復(fù)合酶與堿性蛋白酶可獲得較高的多肽得率，且堿性蛋白酶酶解多肽具有較強的綜合抗氧化能力，在吸油性和乳化性方面也表現(xiàn)更佳。實驗表明堿性蛋白酶的最佳酶解條件為：加酶量36 000 U·g-1，提取溫度55 ℃，提取時間2 h，pH為11，料液比1∶40 g·mL-1。王穎穎等[20]研究表明中性蛋白酶只能有限地水解牡丹籽蛋白，而堿性蛋白酶僅1 h即可完全水解牡丹籽蛋白所有的條帶，產(chǎn)生一系列小于15 kDa的小分子量條帶。堿性蛋白酶還能顯著性地提高蛋白的ABTS和·OH自由基清除活性，在酶解4 h時，兩種自由基的清除率分別達到51.22%和73.66%。研究表明[21]酶解產(chǎn)物的抗氧化性與水解度之間非簡單的線性關(guān)系，即抗氧化能力并非隨著水解度的升高而增大。

除了采用單酶進行酶解，也有研究采用多種不同的酶同時或分步水解蛋白，以提高多肽得率。王封等[22]首先利用纖維素酶解除籽粕中的纖維素對蛋白質(zhì)的束縛，而后通過混合酶組合——Alcalase酶與木瓜蛋白酶對牡丹籽蛋白進行酶解，多肽收率達60%，耗時不超過20 h。

酶解法具有提取率高、選擇性強、反應(yīng)條件溫和、能耗低等特點，對營養(yǎng)成分的破壞性小，一般不存在毒理問題。但酶解制備生物活性肽的過程普遍會產(chǎn)生苦味肽，若應(yīng)用于食品領(lǐng)域，則需要通過吸附劑或外切酶等方式改善口感[23-24]。

1.5 發(fā)酵法

發(fā)酵法通過微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的復(fù)合酶系降解底物，能夠得到水解度較高的產(chǎn)物，無需進行酶的制備與純化。相對于其他方法具有成本較低、產(chǎn)量高、無污染、營養(yǎng)損失少等特點。并且微生物產(chǎn)生的肽酶能夠去除苦味肽，多用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域，目前可用于食品開發(fā)的菌種數(shù)量有限，在選用菌種時需考慮安全問題[24-25]。

趙修華等[26]通過堿溶酸沉提取出牡丹籽蛋白后，分別接入幾種菌種進行發(fā)酵，其中經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵后所得的多肽具有最高的氨基酸含量，為12.36%，且含有大于15種常見氨基酸，多肽水溶性好（溶解度為50 mg·mL-1）。郭鵬等[27]采用由凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌所組成的混合菌以菌液的形式加入脫脂牡丹籽中，通過發(fā)酵提取蛋白質(zhì)，再利用蛋白酶酶解制取多肽，多肽得率在42.5%～51.5%，未經(jīng)發(fā)酵實驗組的多肽得率為34.8%，低于發(fā)酵實驗組，原因是牡丹籽中的木質(zhì)纖維被降解為多糖小分子，減少了其對于蛋白質(zhì)的束縛，蛋白酶因此能夠與蛋白質(zhì)充分接觸，提高酶解效果。

2 牡丹籽多肽的功能活性

生物活性肽是一類具備抗氧化、抑菌、降血壓、血糖等能力的小分子活性物質(zhì)。目前國內(nèi)外許多研究表明牡丹籽粕多肽作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源肽，同樣具有高抗氧化能力、抗菌抑菌能力、免疫活性以及降血壓、血糖等能力。

2.1 抗氧化作用

小分子活性肽作為蛋白質(zhì)主要水解產(chǎn)物，通常具有較好的還原力，清除自由基、螯合金屬離子、抑制活性氧生成等抗氧化活性，能夠有效延緩機體衰老。

研究發(fā)現(xiàn)，牡丹籽多肽的綜合抗氧化能力與谷胱甘肽相近或更優(yōu)[28]。數(shù)據(jù)顯示，酶解產(chǎn)生的多肽分子的抗氧化活性高低與3個因素息息相關(guān)，分別是分子量、氨基酸組成及序列、所帶電荷[29]。王敏等[30]通過實驗表明分子量在1 kDa以下的牡丹籽多肽具有明顯的清除自由基優(yōu)勢，其抗氧化活性受分子量與濃度影響。其中多肽濃度與抗氧化活性之間呈現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性，對5種多肽分子的體內(nèi)抗氧化能力進行深入研究，結(jié)果顯示其抗氧化活性與體外自由基清除實驗相近。根據(jù)氨基酸分析結(jié)果，可得牡丹籽多肽的水解氨基酸中Glu和Asp兩種含量最高[21]。Glu和Asp可與自由基有效結(jié)合，抑制自由基鏈式反應(yīng)，從而清除自由基，顯示出高抗氧化性[31]。

2.2 抗菌抑菌作用

目前，抗生素的濫用已造成更多耐藥菌的產(chǎn)生，而抗菌肽由于具備抗生素替代品的優(yōu)勢而應(yīng)用前景廣闊[32]。以牡丹籽蛋白質(zhì)水解制得的多肽，顯示出良好的抗菌殺菌功效。

胡勇杰等[33]以牡丹肽作為原料制備出一種新型整理劑，當其濃度達到30 g·L-1時，抗菌功效顯著，對4種細菌達到90%以上的抑菌率，其中包括常見的金黃色葡萄球菌以及肺炎桿菌。

2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

牡丹籽多肽在被消化或水解后顯示出免疫活性[34]，能增強非特異性、體液和細胞免疫反應(yīng)[35]。

杜珍奇[36]利用酶解法獲得6種蛋白酶解產(chǎn)物，并研究它們對于正常小鼠免疫活性的調(diào)節(jié)作用，通過動物體實驗，觀察小鼠免疫器官指數(shù)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，結(jié)果表明牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物免疫效果較好，能夠?qū)φＰ∈笙嚓P(guān)免疫器官的發(fā)育起到促進作用，實現(xiàn)小鼠免疫力整體提升。喬慧茹等[19]同樣采用動物體實驗，以小鼠免疫器官作為指標，反映它們的免疫能力強弱，證明了牡丹籽多肽能提高小鼠的免疫器官指數(shù)。同時，牡丹籽粕多肽免疫調(diào)節(jié)能力呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，高劑量相較于中、低劑量的多肽免疫調(diào)節(jié)功效更強。

2.4 降血壓作用

血管緊張素酶（ACE）可發(fā)揮其催化作用并經(jīng)過人體內(nèi)一系列反應(yīng)使血管收縮最后導(dǎo)致血壓升高，而ACE抑制肽作為前者的抑制劑可以起到抑制酶活的作用，從而對人體血壓進行調(diào)控。根據(jù)牡丹籽多肽的氨基酸分析結(jié)果[21]，其所含氨基酸中以Phe、Pro和Tyr居多，而研究表明[37]當多肽C端3個氨基酸包括Phe、Pro、Trp和Tyr時，ACE抑制率會顯著提高。進一步研究發(fā)現(xiàn)[38]，在ACE抑制肽中含有的芳香性氨基酸及疏水氨基酸都能夠提高其抑制活性，而牡丹籽蛋白中疏水性氨基酸占比為20.87%[28]，牡丹籽多肽中則高達50%～75%，實驗制得的5種多肽全部包含芳香族氨基酸[30]。由此可知，在牡丹籽多肽的結(jié)構(gòu)上，表現(xiàn)出了其作為ACE抑制肽優(yōu)質(zhì)來源的潛能。陳秋鑾等[38]采用中性蛋白酶酶解牡丹籽蛋白制備ACE抑制肽，得到其在最佳工藝條件下的抑制率可達到（86.93±2.38）%。中性水解酶主要酶切位點為Phe-、Trp-和Tyr-，且能夠在多肽的C末端進行特異性酶切產(chǎn)生芳香族氨基酸或疏水性氨基酸，故能夠得到ACE抑制活性較高的多肽[39]。

2.5 降血糖作用

牡丹籽粕多肽屬于小分子活性肽，能夠在人體內(nèi)發(fā)揮更高的活性且毒副作用更低。有研究表明，抑制α-葡萄糖苷酶活性能夠有效抑制葡萄糖吸收進而有助于控制糖尿病。顏輝等[40]以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標得牡丹籽多肽的實際抑制率為22.21%。有研究者發(fā)明出一種油用牡丹籽粕源的降血糖多肽，實驗證明該降血糖多肽主要活性成分的氨基酸序列為Tyr-Phe-Phe-Met（YFFM）[41]。通過對6種不同的酶解牡丹籽粕多肽抑制活性研究可知，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的活性最高，且其抑制能力隨多肽濃度的升高而提高[19]。

3 結(jié)語

隨著人們對功能性健康食品與化妝品的需求不斷增加，生物活性多肽類化合物由于具有高生物活性、安全無毒、無刺激性、易吸收等優(yōu)勢而備受關(guān)注。牡丹籽粕作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，絕大多數(shù)只是被用作蛋白飼料，經(jīng)濟效益低。牡丹從古代以來就一直作為中藥發(fā)展至今，其藥用價值被認為在牡丹根（丹皮）中最大，且多數(shù)研究集中于黃酮、多酚化合物等成分的功效上，對牡丹籽中多肽的研究極少，可能與提取技術(shù)的局限及蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性有關(guān)。

近年來，使用不同方法提取牡丹籽蛋白的研究逐漸增多，以堿溶酸沉與酶解法為主。將化學法與物理法或酶法相結(jié)合能夠提高提取效果，今后可使用復(fù)合提取的方法探索最佳提取工藝。目前牡丹籽蛋白提取率與純度不高的原因可能與原料特性有關(guān)，為制備純度更高的牡丹籽蛋白及加大其應(yīng)用范圍，可進一步研究其功能特性。篩選穩(wěn)定性較高的功能性多肽，同時尋找合適的穩(wěn)定劑，實現(xiàn)低價值資源向高價值資源的轉(zhuǎn)化，充分發(fā)揮其作為天然植物蛋白資源的作用。