食品檢測中PCR技術(shù)的應(yīng)用研究

◎ 鄭 昆，楊 紅（．吉林化工學院 工程學院，吉林 吉林 30；．吉林通用航空職業(yè)技術(shù)學院，吉林 吉林 3000）

PCR技術(shù)的全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)，能夠迅速擴增指定基因的DNA序列，最早應(yīng)用于基因克隆、轉(zhuǎn)基因檢測等領(lǐng)域。由于PCR技術(shù)的精準性較強，逐步被應(yīng)用到其他的領(lǐng)域。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，人們?nèi)遮吜私饬耸澄镏形⑸锏倪z傳性質(zhì)，因此也開始在食品檢測領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用PCR技術(shù)。其中，食品中致病菌檢測、成分類別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測等是PCR技術(shù)的主要應(yīng)用方向。

1 PCR技術(shù)的應(yīng)用原理及關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.1 應(yīng)用原理

在基因工程領(lǐng)域，PCR技術(shù)是非常關(guān)鍵的一項技術(shù)，目前在食品檢測中得到了十分廣泛的應(yīng)用。本技術(shù)主要依托PCR體系增溫處理需檢測的食物，在增溫過程中，改變食物中微生物的核酸序列。一般來講，在94 ℃的初始溫度條件下即可裂解微生物的DNA，隨后分別進行降溫與增溫處理，產(chǎn)生新的DNA片段。通過對獲得產(chǎn)物的特異性DNA片段進行檢查，即可完成食物檢測任務(wù)。

通常情況下，可從這些方面劃分PCR技術(shù)的應(yīng)用流程。①通過對離心法、過濾法等進行運用，有效純化、提取食品中的DNA。②基于PCR技術(shù)的支持，擴增處理DNA。③深入分析擴增到的產(chǎn)物，分析步驟包括變性、退火與延伸。變性階段主要是拆分食品DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，退火階段主要是配對結(jié)合引物與模板DNA單鏈的互補序列，而延伸階段則可促使新的特征性成分DNA得到形成[1]。

1.2 關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.2.1 引物設(shè)計

PCR的擴增特異性會在很大程度上受到引物設(shè)計的影響，在食品致病菌、非致病菌檢測過程中，試驗對樣本的擴增特異性提出了較高的要求，若擴增特異性不足，那么PCR檢測結(jié)果的精確性將難以保證。因此，在應(yīng)用PCR技術(shù)的過程中，要充分重視引物設(shè)計環(huán)節(jié)。其中，引物設(shè)計質(zhì)量受食品遺傳背景的影響較大，工作人員需深入分析檢測對象的遺傳背景。通常情況下，經(jīng)驗豐富的檢測人員能夠深入掌握常見食品的遺傳背景，部分食品較為特殊，則要對其檢測背景進行特意分析與了解[2]。

1.2.2 模板制備

PCR技術(shù)的應(yīng)用結(jié)果會受到模板制備質(zhì)量的影響，在制備過程中，工作人員要清除掉樣本中的PCR抑制分子，移除掉DNA蛋白與有機溶劑，以便促使樣本檢測質(zhì)量得到提高。

2 食品檢測中PCR技術(shù)的主要應(yīng)用

2.1 食品致病菌檢測中的應(yīng)用

在食品檢測體系中，非常關(guān)鍵的項目為致病菌檢測。傳統(tǒng)檢測技術(shù)的實施環(huán)節(jié)眾多，如富集培養(yǎng)、分離培養(yǎng)等，需花費較長的檢測時間，一般要在5 d以上，這樣食品檢測的時效性將會大打折扣。而通過應(yīng)用PCR技術(shù)，則可在很大程度上提高檢測效率。PCR技術(shù)只有較少的檢測環(huán)節(jié)，檢測時間可以壓縮在1 d以內(nèi)。在具體實施中，先利用電泳法對0.1 mg DNA中拷貝模板程序數(shù)量進行檢測，之后借助于PCR技術(shù)檢測擴增細菌中的殘留DNA片段。在這一檢測過程中，致病菌培養(yǎng)環(huán)節(jié)得到省略，檢測程序較為簡單。檢測流程如下。①通過對離心沉淀、濾膜過濾等技術(shù)進行綜合利用，深入分析食品樣本中的細菌細胞。②實施細胞裂變，以便對細胞中的DNA進行獲取。③借助于特異性核酸探針、電泳法等檢測DNA序列，將細菌種類、數(shù)量等確定出來[3]。

最早PCR技術(shù)應(yīng)用于沙門氏菌檢測中，目前檢測技術(shù)日趨成熟，沙門氏菌的檢測需求可以得到充分滿足。且在實踐發(fā)展中形成了很多新的檢測方法，如多重PCR檢測技術(shù)等。同時，在很大程度上拓展了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍，通過結(jié)合使用基因探針、PCR技術(shù)等，可高效檢測金黃色葡萄球菌等致病菌，得到準確、可靠的檢測結(jié)果。

2.2 食品非致病菌檢測中的應(yīng)用

PCR技術(shù)能夠檢測食品中的非致病菌，目前主要應(yīng)用于食品中乳酸菌檢測領(lǐng)域。乳酸菌的種類較多，分布較廣，生物化學價值較高。結(jié)合研究得知，大部分乳酸菌有益于人體健康，但也存在著許多有害乳酸菌。乳酸菌的環(huán)境抵抗力較強，甚至能夠長期生存于真空環(huán)境中。因此，有益乳酸菌一般作為添加劑、防腐材料等應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，使食物的腐敗率得到有效降低，食物的保質(zhì)期得以延長。在食品乳酸菌檢測中應(yīng)用PCR技術(shù)時，要對乳酸菌的產(chǎn)生規(guī)律進行準確把握，獲取乳酸菌的菌落信息后，借助于引物設(shè)計對乳酸菌的發(fā)酵過程進行檢查，從而了解乳酸菌類型以及保質(zhì)期內(nèi)的腐敗度等[4]。此外，在生物實驗室中也可借助于PCR技術(shù)檢測乳酸菌含量，如檢測酸奶食品等。結(jié)合實踐得知，PCR技術(shù)能夠?qū)κ称分械娜樗峋窟M行較為準確的測定。

2.3 轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

現(xiàn)階段，食品工程中開始廣泛應(yīng)用基因工程技術(shù)，市場中出現(xiàn)了較多種類的轉(zhuǎn)基因食品，如大豆、玉米等。為促使轉(zhuǎn)基因食品的質(zhì)量安全得到保證，消除社會公眾的誤解，需要對轉(zhuǎn)基因食品中的成分進行定性與定量分析。而PCR技術(shù)的檢測操作難度較小，整體檢測效率較高，已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測當中。

2.4 食品有效成分檢測中的應(yīng)用

社會公眾日趨關(guān)注食品質(zhì)量問題，在食品選購時往往要認真觀察食品的營養(yǎng)成分表。但人們難以利用肉眼檢測出食品真實的營養(yǎng)成分狀況，因此部分企業(yè)對營養(yǎng)成分進行虛假標注。針對這種情況，可借助于PCR技術(shù)準確檢測、鑒別食品中的營養(yǎng)成分及含量，促使消費者的知情權(quán)得到保證。此外，利用PCR技術(shù)也能夠有效檢測肉類及其制品的動物成分，對可能含有的其他動物性成分進行準確識別，進而提高各類食品的質(zhì)量安全水平。

3 PCR技術(shù)應(yīng)用時的注意事項

為將PCR技術(shù)的檢測優(yōu)勢充分發(fā)揮出來，提高食品檢測效率和準確性，需嚴格管控檢測過程，明確關(guān)鍵事項。

3.1 有效制備PCR模板

沒有科學制備PCR模板，那么食品安全檢驗結(jié)果的準確性將得不到保證。主要原因是有數(shù)萬種PCR抑制因子存在于食品與生活環(huán)境中，如果沒有將PCR模板中的抑制因子清除掉，那么DNA提取過程將會受到影響，且無法全面去除掉蛋白質(zhì)有機溶劑，難以完整提取DNA，無法反映檢測對象的致病菌、非致病菌的真實狀況，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準確性、可靠性得不到保證。

3.2 充分重視檢測污染問題

樣本采集是食品檢測的重要環(huán)節(jié)，一旦有污染問題出現(xiàn)于樣本采集、運輸過程中，即便應(yīng)用先進的PCR技術(shù)，也難以對食物的真實質(zhì)量安全狀況進行反映。同時，在PCR技術(shù)檢測過程當中，也可能會污染樣本或模板。因此，需要工作人員將無菌控制要求貫徹于檢測操作全過程中，對槍頭進行及時更換，避免出現(xiàn)交叉污染、樣品污染等問題，促使食品檢測結(jié)果的客觀性、準確性等得到保證。

3.3 保證檢測對象的生物活性

如果檢測對象的生物活性難以得到保持，將會在很大程度上影響到檢測結(jié)果的準確性。在檢測核酸物質(zhì)食品時，保持食品的生物活性才可以對DNA信息進行有效提取，進而促進PCR擴增的順利實現(xiàn)[5]。

4 食品檢測中PCR的改進技術(shù)

4.1 實時定量PCR技術(shù)

實時定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光基團，利用熒光信號實時檢測PCR的過程。由于模板的Ct值與模板的起始拷貝數(shù)之間存在一定的線性關(guān)系，因此可進行定量分析。此技術(shù)于完全閉管條件下開展，且PCR后的處理工序得到省略，可避免交叉?zhèn)魅締栴}的出現(xiàn)。同時，檢測周期得到了顯著縮短，操作難度較小，能夠獲取到準確、特異的檢測結(jié)果。目前，在食品病原微生物檢測、摻加量檢測等領(lǐng)域應(yīng)用較多。

4.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是將多對引物加入到反應(yīng)系統(tǒng)中，以此來實現(xiàn)多目標DNA片段擴增目的。各個目標片段具有差異化的大小，通過多重擴增，可直接分析凝膠成像。和常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比，本種技術(shù)能夠同時擴增多目標DNA片段，可促使模板DNA、檢測時間、檢測成本等得到有效節(jié)約。

4.3 PCR-DGGE技術(shù)

PCR-DGGE技術(shù)有機結(jié)合了PCR技術(shù)與變形梯度凝膠電泳技術(shù)，能夠分離長度相同的不同堿基的DNA片段。PCR-DGGE技術(shù)具有較強的特異性和敏感性，可有效分辨堿基。依托成像體系分析經(jīng)過染色后的凝膠，能夠?qū)悠返姆爆嵭越o反映出來。而借助于條帶數(shù)量，可反映樣品中不同微生物的組成，依據(jù)條帶亮度能夠?qū)ξ⑸飻?shù)量進行掌握。

5 結(jié)語

綜上所述，傳統(tǒng)食品檢測技術(shù)具有較為繁瑣的操作步驟，需花費大量的時間和精力，且不具備良好的靈敏度。而PCR技術(shù)則能夠有效簡化食品安全檢測流程，增強檢測結(jié)果的準確性與可靠性。因此，PCR技術(shù)在食品檢測中應(yīng)用十分廣泛，促進了食品檢測業(yè)的快速發(fā)展。為切實凸顯PCR檢測技術(shù)的優(yōu)勢，工作人員要嚴格依據(jù)相應(yīng)的流程和規(guī)范開展食品檢測工作，嚴格控制各個檢測環(huán)節(jié)。