PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

◎ 劉沛明

（合浦縣食品藥品檢驗檢測中心，廣西 北海 536100）

在食品安全檢測工作中，微生物檢測不僅在技術(shù)難度上相對較高，同時還具有檢測范圍廣、需檢驗食品種類多的特點，如食品生產(chǎn)加工環(huán)境、原輔料、加工工具、包裝材料以及飲用水、水果、海鮮以及蔬菜等各類加工食品，基本都屬于微生物檢測范圍，檢測難度很高，單純依靠傳統(tǒng)檢測技術(shù)方法很難保證檢測的準確性，若要使食品衛(wèi)生檢測效果得到進一步優(yōu)化，需要對PCR等先進技術(shù)展開深入研究并進行應(yīng)用實踐。

1 PCR技術(shù)概述

PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)通常是指以DNA半保留復(fù)制原理為核心實現(xiàn)生物特定DNA片段擴增的一種分子生物學(xué)技術(shù)，目前在生物醫(yī)學(xué)、分子考古學(xué)等領(lǐng)域都有著比較廣泛且有效的應(yīng)用。從原理上來看，PCR技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用大多是通過對生物DNA天然復(fù)制過程的體外模擬來實現(xiàn)的，由于生物DNA為雙螺旋結(jié)構(gòu)，且遵循碳基互補配對規(guī)律，復(fù)制后子代DNA分子雙鏈中僅有一條來自親代，因此只需按照DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、堿基互補配對規(guī)律進行聚合酶鏈式反應(yīng)實驗，就能夠在生物體外模擬出DNA天然復(fù)制的全過程，這意味著在對物品上病毒、細菌等微生物進行檢測時，檢測人員可以省略傳統(tǒng)的微生物分離或細胞培養(yǎng)工作，直接利用生物血液、活組織、細胞等臨床標本來完成DNA擴增，從而獲得準確的檢測結(jié)果。PCR技術(shù)無論在生物醫(yī)學(xué)、分子考古學(xué)等學(xué)科的研究工作中，還是在食品安全檢測工作中，都能夠發(fā)揮出十分關(guān)鍵的作用[1]。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢特點

2.1 檢測結(jié)果更加準確

在食品微生物檢測工作中，食品微生物種類非常多，且不同微生物間的特性差異并不十分明顯，因此利用微生物培養(yǎng)、免疫擴散、凝聚反應(yīng)等傳統(tǒng)檢測方法來進行檢測往往很難保證檢測結(jié)果的準確性，尤其對于食品中較常見的各種活性較弱的細菌，其檢測結(jié)果更容易出現(xiàn)偏差，即便能采用熒光素酶測定、核酸分子雜交等檢測方法來提高準確性，也會面臨檢測方法適用范圍有限的問題。而在PCR技術(shù)的支持下，檢測人員能夠從待檢測食品中提取部分樣品，并對樣品進行PCR實驗，對特定DNA分子進行大量復(fù)制，獲取更多的DNA目的片段（通常為數(shù)十乃至上百倍），在大量DNA目的片段的支持下，檢測人員能夠?qū)崿F(xiàn)對微生物種類、數(shù)量的準確測定，保證檢測結(jié)果的準確性[2]。

2.2 檢測效率相對較高

在多樣化的傳統(tǒng)微生物檢測方法中，雖然部分方法的檢測速度較快，能夠在數(shù)小時內(nèi)完成檢測，但應(yīng)用范圍往往十分有限，能夠適應(yīng)多種復(fù)雜情況的食品微生物檢測方法在相關(guān)應(yīng)用實踐中基本都需要耗費較長的檢測時間，例如用微生物培養(yǎng)法進行微生物檢測時，需要提前耗費較長時間準備培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)微生物的過程中根據(jù)微生物類型調(diào)整其生長環(huán)境的pH值、生長溫度。在PCR技術(shù)的支持下，檢測人員獲取大量DNA片段所需的時間較短，有助于食品微生物檢測效率的提升[3]，另外，相對于高度依賴人工操作的傳統(tǒng)微生物檢測方法，PCR技術(shù)更具標準化、規(guī)范化的特點，很多檢測操作可以借助自動化控制系統(tǒng)和專業(yè)儀器設(shè)備完成，通常只需一人負責(zé)控制設(shè)備即可快速完成檢測。

2.3 檢測操作簡單便捷

與其他微生物檢測技術(shù)方法相比，PCR技術(shù)在具體操作上更簡單、便捷，對檢測人員的要求也相對較低，更適合在食品安全檢測工作中推廣應(yīng)用，例如在檢測樣品采集方面，很多傳統(tǒng)檢測方法都需要先從食品上取樣，將樣品中病毒、細菌等微生物分離出來才能夠開始正式檢測，但PCR技術(shù)無需進行樣品中微生物的分離工作，可直接將血液、活組織等臨床標本或其他DNA粗制品作為DNA片段擴增模板，檢測操作更為簡單。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的具體應(yīng)用

3.1 沙門氏菌檢測

沙門氏菌屬于革蘭性陰性桿菌，其種類多，對哺乳動物有極大危害性，人類攝入很容易食物中毒，引發(fā)胃腸炎、敗血癥、傷寒等疾病，甚至可能致死，是當前食品微生物中的重點檢測對象。沙門氏菌在各種生產(chǎn)加工工藝的影響下，會發(fā)生含量降低等變化，其檢測難度相對較高，檢測準確率也無法保證，而此問題在PCR技術(shù)中能夠得到有效解決[4]。實際檢測過程中，檢測人員通常只需從待檢測食品（或嘔吐物等）中取樣，與引物一同放入專業(yè)檢測儀器中，由儀器自動完成檢測，從而實現(xiàn)對不同血清型沙門氏菌的準確判斷，檢測時長基本在1 d以內(nèi)，理想情況下甚至只需2 h左右。

3.2 金黃色葡萄球菌檢測

金黃色葡萄球菌屬革蘭氏陽性桿菌，是常見的人畜共患病病原菌，容易對奶制品、肉色拉等食品造成污染，人體一旦攝入了受金黃色葡萄球菌污染的食物，病菌會立即吸附在腸胃道黏膜上，產(chǎn)生具有較強毒性的腸毒素，最終引發(fā)敗血癥、皮膚軟組織感染、肺炎、腸炎、腦膜炎等疾病，危害性非常強，也是食品微生物中的重點檢測對象。最初大多數(shù)檢測機構(gòu)采用免疫擴散、凝集反應(yīng)等方法檢測食品中的金黃色葡萄球菌，但這些方法的檢測局限性相對較大，僅能測定食品中是否存在金黃色葡萄球菌，無法確定金黃色葡萄球菌中是否含有腸毒素基因，難以為食品危害性判斷提供幫助，因此近些年來不少檢測機構(gòu)逐漸開始利用PCR技術(shù)進行檢測，對樣品在PCR實驗中發(fā)生的聚合酶鏈式反應(yīng)進行觀察記錄，并圍繞樣品中的DNA分子結(jié)構(gòu)及RNA組成編碼展開全面分析，得到更加詳細、準確的食品中金黃色葡萄球菌檢測數(shù)據(jù)[5]。

3.3 大腸桿菌檢測

大腸桿菌作為腸道菌群中的一類細菌，大多數(shù)情況下不會對人體造成危害，但仍有少部分大腸桿菌會產(chǎn)生有害人體的毒素。大腸桿菌產(chǎn)生的毒素通常并無差異，因此利用傳統(tǒng)的微生物檢測方法難以進行有效區(qū)分，對于腸出血性大腸桿菌等有害細菌的判斷更為困難，將PCR技術(shù)應(yīng)用到有害大腸桿菌檢測中，則能夠充分發(fā)揮其確定基因序列方面的優(yōu)勢，獲得大腸桿菌中特征顯著的各類檢測因子，并據(jù)此對大腸桿菌的種類做出準確判斷[6]。

3.4 乳酸菌檢測

乳酸菌廣泛存在于各類食品中，不會對人體造成危害，有防治乳糖不耐癥、促進人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)、抑制膽固醇吸收、提高人體免疫力等重要生理功能，但乳酸菌可在真空環(huán)境下長期生存，并且可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸，即便在真空包裝的食品中也能夠?qū)崿F(xiàn)快速生長繁殖，導(dǎo)致食品腐敗，因此在食品微生物檢測工作中，通常還會對乳酸菌這一非致病菌進行檢測。其相關(guān)檢測方法往往與PCR技術(shù)有密切關(guān)系，例如在乳酸菌的分類鑒定檢測中，需要利用聚糖酶、氨基肽酶N、德氏乳桿菌等蛋白/酶編碼基因作為靶序列設(shè)計出乳酸菌分類鑒定的引物，之后再利用采集到的待檢測樣品進行PCR實驗，使樣品中DNA目的片段能夠?qū)崿F(xiàn)迅速擴增并產(chǎn)生具有明顯排他性的唯一條帶，為乳酸菌種類的準確判斷提供依據(jù)，另外，還可以利用PCR技術(shù)對各類乳酸菌的繁殖規(guī)律展開研究，確定食物中乳酸菌產(chǎn)出率的變化情況（受發(fā)酵時間影響），進而對食品保質(zhì)期進行合理判斷。

4 結(jié)語

PCR技術(shù)作為新興的分子生物學(xué)技術(shù)，雖然能夠在食品微生物檢測工作中發(fā)揮出重要作用，使各類微生物的檢測效率、檢測準確性及檢測操作便捷性得到明顯提升，但要將這些優(yōu)勢充分發(fā)揮，仍需要根據(jù)沙門氏菌、大腸桿菌等食品微生物主要檢測對象的實際檢測需求對PCR技術(shù)進行靈活應(yīng)用。