椎間盤退變動物模型的研究進展

顏昊,賈永偉,*,翟偉峰

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 200000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院脊柱外科,上海 200052)

椎間盤退變是臨床上常見的疾病,其發(fā)病機制尚不明確,且給社會勞動力帶來沉重負擔(dān),對社會經(jīng)濟造成一定影響[1]。隨著我國人口老齡化程度的加劇以及人們生活方式的改變,其發(fā)病率逐漸增多,椎間盤退變已經(jīng)成為脊柱外科醫(yī)生研究的熱點問題。動物模型是研究椎間盤退變的病因、發(fā)病規(guī)律和病理學(xué)變化的重要手段,目前椎間盤退變模型已有數(shù)十種構(gòu)建方法,然而,至今仍未有一種公認的理想模型,本文結(jié)合國內(nèi)外實驗動物模型的差異和優(yōu)缺點作一綜述,為今后動物模型的選擇與構(gòu)建提供參考。

1 實驗動物的選擇

目前用于構(gòu)建椎間盤退變模型的動物主要分為大型動物與小型動物。常用于實驗動物的排名如下:小鼠腰椎(12%),大鼠腰椎(15%),小鼠尾巴(18%),狒狒(19%),牛尾巴(22%),兔子(26%),綿羊(31%)以及大鼠尾巴(46%)[2]。

1.1 大型動物

1.1.1 靈長類

靈長類動物的生活特性和人類相近,脊柱的生理構(gòu)造和生物力學(xué)環(huán)境與人類有很高的相似度[3]。Lauerman等[4]通過對平均年齡為15.7歲的狒狒進行影像觀察,發(fā)現(xiàn)狒狒的駝背程度及椎間盤退變程度與年齡呈正相關(guān),與人類的椎間盤退變規(guī)律相似。郭常安等[5]以恒河猴為對象進行纖維環(huán)切開,發(fā)現(xiàn)恒河猴生理特性與人類較接近。雖然靈長類動物在椎間盤退變實驗中是最理想的實驗?zāi)Ｐ?其椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)與人類較類似,且存在自發(fā)性退變、直立行走應(yīng)力等相同因素,但造模的價格昂貴,不適合大數(shù)量的實驗要求,且倫理難以通過。

1.1.2 牛、羊

牛、羊脊柱的解剖結(jié)構(gòu)、大小與人類相似,且取材方便。Paul等[6]發(fā)現(xiàn)成年山羊椎間盤中只有軟骨細胞以及成纖維細胞,并未發(fā)現(xiàn)脊索細胞,這一點與人類相似。另一方面,山羊椎間盤中所測到的水、糖胺聚糖以及膠原蛋白含量與成人椎間盤高度吻合[7],因此可作為一種理想的研究對象,相比于其他動物,牛羊類較為強壯,對一些手術(shù)類造模方式易于耐受,但是應(yīng)用?；蜓蜃鳛閯游锬Ｐ?實驗的經(jīng)濟成本會有所提高。

1.1.3 豬

國內(nèi)將豬作為動物模型的研究較少,在國外比較早期文獻中獲知,豬與綿羊脊椎單個節(jié)段的左右軸轉(zhuǎn)向程度與人類較相似(C1-C2運動度最大),但在豬、牛、綿羊等大型動物中,從頸椎到腰椎骨性終板的前后直徑是幾乎相同的,而人類的前后直徑呈逐步增加[8]。脊索細胞在椎間盤退變的情況下具有保護作用,而豬椎間盤內(nèi)的脊索細胞在出生后長期或者終身存在[9]。豬由于在生理學(xué)方面與人類極為相似,且其體型較大,易于操作,在國外作為模型動物得到了廣泛的應(yīng)用[10-11]。

1.1.4 犬類

犬類應(yīng)用于椎間盤動物模型主要有軟骨營養(yǎng)不良犬和非軟骨營養(yǎng)不良犬。在軟骨營養(yǎng)不良犬的幼犬(<1歲)中發(fā)現(xiàn)了退化的跡象,如比格犬與臘腸犬從出生時脊索細胞開始減少,到成年期完全喪失,而非軟骨營養(yǎng)不良犬中老年犬(5～7歲)才出現(xiàn)退化的跡象[12]。其次犬在自發(fā)性椎間盤退變中的相對糖胺聚糖含量和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性與人相似:隨著椎間盤退變嚴重程度的提高,MMP活性增加而糖胺聚糖含量降低[13]。所以在自發(fā)性退變模型上,犬類是不錯的選擇,但會因此提高實驗成本,相對的動物培育周期延長,且在其他造模方式上,犬類椎間盤的大小與人類形成差異。

1.2 小型動物

1.2.1 鼠類

目前最常用的主要為大、小鼠,沙鼠。Lim等[14]對SD大鼠取出部分脊柱運動段,在體外進行14 d培養(yǎng),所培養(yǎng)的纖維環(huán)、髓核、終板存活率保持95%以上。Ariga等[15]對小鼠椎間盤進行了機械應(yīng)力實驗,發(fā)現(xiàn)軟骨終板中軟骨細胞凋亡與機械應(yīng)力有關(guān),且該過程與椎間盤退變存在一定聯(lián)系。Gruber等[16]發(fā)現(xiàn)沙鼠的椎間盤退變與年齡相關(guān),其主要原因與沙鼠的高鹽含量、低水飲食習(xí)慣有關(guān),從而引發(fā)椎間盤的營養(yǎng)障礙,但高鹽、低水飲食因素是否能普遍代表人類椎間盤疾病特點仍存在爭議。大小鼠作為動物模型可以控制經(jīng)濟成本;且品系培養(yǎng)方便,培養(yǎng)周期短,基因純合度高,但大小鼠椎間盤大小與人類差異較大,對實驗的操作有一定技術(shù)要求,其較小的椎間盤會給影像學(xué)及病理學(xué)等檢測帶來困難。

1.2.2 兔類

兔類作為動物模型用于體內(nèi)模型較多,Lipson等[17]發(fā)現(xiàn)造模前兔椎間盤含水量及蛋白聚糖單體大小與人類相似,損傷后兔椎間盤含水量在前兩天短暫恢復(fù),透明質(zhì)酸含量則迅速下降,但蛋白聚糖含量未見明顯改變。Bayliss等[18]研究表明隨著兔的衰老,其纖維軟骨細胞代謝及蛋白聚糖分泌量的變化,進一步導(dǎo)致生物化學(xué)成分發(fā)生改變,這點與人類的椎間盤退變過程也較類似。Kroeber等[19]發(fā)現(xiàn)相比于嚙齒類動物的尾巴模型,兔模型與包含小關(guān)節(jié)、椎旁肌肉和韌帶的人椎間盤同源性更高。作為實驗動物,兔類的飼養(yǎng)方便,品系及遺傳學(xué)控制較好,能縮減成本,且相對于鼠類,兔類的椎間盤較大易于實驗操作。

總體來說,由于在實際實驗中需比較動物環(huán)境要求、遺傳學(xué)控制、飼養(yǎng)特點、經(jīng)濟成本、是否易于操作以及倫理要求等因素,目前鼠類和兔類暫時是比較適合進行椎間盤退變實驗的動物。

2 動物模型的建立

椎間盤退變的動物模型根據(jù)造模方法不同分為體內(nèi)模型與體外模型。體內(nèi)模型包括:力學(xué)改變模型、結(jié)構(gòu)改變模型、自發(fā)退變模型、全身疾病模型。體外模型包括:體外細胞模型、體外器官模型。

2.1 體內(nèi)模型

2.1.1 力學(xué)改變模型

在長時間不正確姿勢或者過度承受壓力下,椎間盤退變的風(fēng)險明顯增高,因此部分學(xué)者采用機械應(yīng)力等手段模擬出椎間盤退變模型,主要有:尾部折彎模型、雙足直立模型、軸向加壓模型和脊柱失穩(wěn)模型。

(1)尾部折彎模型:早在1957年,Lindblom等[20]將老鼠尾巴彎曲成“U”型以增加髓核、纖維環(huán)壓力,誘發(fā)椎間盤退變,發(fā)現(xiàn)凹面的結(jié)締組織出現(xiàn)損傷以及椎間盤細胞質(zhì)減少。Court等[21]發(fā)現(xiàn)對尾部加壓彎曲后會導(dǎo)致細胞死亡,蛋白聚糖基因表達降低且II型膠原蛋白表達對稱性降低。但是,尾部折彎模型因鼠類尾部生理結(jié)構(gòu)、壓力結(jié)構(gòu)與人類椎間盤存在明顯差異,且彎曲部會存在結(jié)締組織損傷、細胞數(shù)目減少等現(xiàn)象,目前應(yīng)用較少。

(2)雙足直立模型:Cassidy等[22]對21只新生大鼠進行去前肢模擬椎間盤退變的實驗,研究發(fā)現(xiàn)所有大鼠腰椎發(fā)生楔形變,且腰大肌中I型肌纖維轉(zhuǎn)變?yōu)镮I型肌纖維,多裂肌中II型肌纖維轉(zhuǎn)變?yōu)镮型肌纖維。Moravec等[23]研究雙足模型并未發(fā)現(xiàn)四足與兩足大鼠之間存在明顯的直立姿勢差異。Bailey等[24]對雙足直立模型再次進行研究后發(fā)現(xiàn):四足和雙足大鼠在站立次數(shù)或直立水平姿勢移動量上較接近,認為直立姿勢可能不是導(dǎo)致椎間盤退變的因素。因此,目前雙足模型不被推薦作為椎間盤退變模型。

(3)軸向加壓模型:Iatridis等[25]應(yīng)用Ilizarov型器械對16只大鼠尾巴進行持續(xù)加壓,實驗顯示大鼠尾部椎間盤厚度、角度及松弛度降低,尾部椎間盤的機械性質(zhì)及結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化,與人類較相似,但實驗椎間盤中蛋白聚糖含量增加,這與人類椎間盤退變蛋白聚糖含量降低恰恰相反。Kroeber等[19]對此模型進行了改進:在兔子腰椎上安裝可控的靜態(tài)軸向加壓裝置,14 d及28 d時發(fā)現(xiàn)椎間盤高度降低、終板纖維化且凋亡細胞增多,在卸載裝置4周后,這些變化表現(xiàn)為不可逆轉(zhuǎn)。因軸向加壓模型可控性及可重復(fù)性較高,且造模周期相對較短,其在國內(nèi)外研究椎間盤退變中應(yīng)用較多,但軸向加壓模型通常采用手術(shù)方式來構(gòu)建,存在一定技術(shù)要求,實際操作中需注意對感染的控制。

(4)脊柱失穩(wěn)模型:主要是通過椎體結(jié)構(gòu)、椎旁肌刺激、脊柱融合的手段造成脊柱不穩(wěn),從而引發(fā)椎間盤退變的方法。Miyamoto等[26]通過切除小鼠棘突、棘上韌帶、棘間韌帶及剝離相應(yīng)的椎旁肌使脊柱失穩(wěn)引發(fā)椎間盤退變,實驗發(fā)現(xiàn)造模后椎間盤高度下降、軟骨細胞增生,骨贅形成。Wada等[27]對兔的斜方肌反復(fù)電刺激使兔的頸椎反復(fù)伸展屈曲,造成頸椎失穩(wěn),研究發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)出現(xiàn)了嚴重的分層以及骨贅形成。但是該模型造模時間相對過長,實驗成本較高,且其退變因素是否包含手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)仍存在爭議。

2.1.2 結(jié)構(gòu)損傷模型

結(jié)構(gòu)損傷模型通過物理或化學(xué)的方式使椎間盤結(jié)構(gòu)破壞引發(fā)退變,目前分為物理損傷模型以及化學(xué)損傷模型。

(1)物理損傷模型:

纖維環(huán)損傷模型:Keyes等[28]首次通過對纖維環(huán)的損傷引發(fā)椎間盤退變。此模型在后人不斷的發(fā)展下主要分為纖維環(huán)局部損傷以及累及髓核的纖維環(huán)全層損傷。Osti等[29]對21只山羊在不損傷內(nèi)層纖維環(huán)的情況下進行纖維環(huán)切開,在術(shù)后4～12月中所有纖維環(huán)均發(fā)生破裂,術(shù)后18月所有纖維環(huán)切開模型出現(xiàn)退變:椎間盤高度下降且髓核中蛋白聚糖含量減少,他們認為纖維環(huán)在椎間盤退變中發(fā)揮了重要作用。為進一步增加該方法的可控性和可重復(fù)性,近年來,部分學(xué)者采用針刺法來誘導(dǎo)椎間盤退變,獲得了滿意的結(jié)果[30-31]。纖維環(huán)損傷模型是目前比較常用的造模方式,可短期內(nèi)大量重復(fù),但與人類自然退變的時間有明顯差異,且對實驗者的操作有一定技術(shù)要求。

終板損傷模型:該模型主要是應(yīng)用物理或化學(xué)的手段損傷軟骨終板以減少椎間盤血供及營養(yǎng)誘發(fā)椎間盤退變。Cinotti等[32]對豬進行了多處終板穿刺與單處終板穿刺,實驗顯示兩者均能引起椎間盤退變,但多處穿刺方法退變效果較明顯,且髓核中尿酸含量與終板損傷程度呈負相關(guān)。Hutton等[33]對犬的上下終板之間注入骨水泥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模的椎間盤并未出現(xiàn)明顯的退變現(xiàn)象,髓核與纖維環(huán)中蛋白聚糖的含量顯著增加。終板損傷模型對操作要求較高,可重復(fù)性較差,難以保證終板損傷程度一致,且也存在與椎間盤自然退變的差異的問題,目前應(yīng)用較少。

髓核損傷模型:在纖維環(huán)穿刺基礎(chǔ)上,劉航濤等[34]經(jīng)纖維環(huán)對髓核直接穿刺并抽吸髓核制作退變模型,造模后模型椎間盤間隙明顯變窄,且II型膠原及蛋白多糖含量明顯降低。Kim等[35]用鉆頭對大鼠椎間盤穿刺并抽吸髓核,在術(shù)后第9周觀察到椎間盤損傷變性,伴隨蛋白聚糖含量下降以及椎間盤高度變窄。對比纖維環(huán)穿刺方法,此方式操作相對簡單、椎間盤退變時間更短,且影像學(xué)表現(xiàn)及病理結(jié)果與人類椎間盤退變較相似,但此方法會合并纖維環(huán)損傷,加速椎間盤退變過程,與人類椎間盤退變時間較緩慢形成差異。

(2)化學(xué)損傷模型其主要方式是通過向椎間盤內(nèi)注射酶類(軟骨素酶ABC、木瓜凝乳蛋白酶、腫瘤壞死因子α等)或非酶類藥物(博來霉素等),使髓核細胞死亡、基質(zhì)減少,誘發(fā)椎間盤退變[36-38]。化學(xué)損傷模型操作相對簡單,能夠短期內(nèi)誘發(fā)椎間盤退變,但退變方式同樣與自然退變存在差異,對椎間盤造成一定程度損害,且可能影響一些實驗生化指標(biāo)。

2.1.3 自發(fā)退變模型

(1)自發(fā)退變動物模型:沙鼠是一種伴隨年齡增長逐步出現(xiàn)腰椎退變的動物,其椎間盤退變具有出現(xiàn)早、發(fā)生率高、遺傳性相對較高的特點,在最近研究中部分學(xué)者對其椎間盤形態(tài)學(xué)特征有了新的發(fā)現(xiàn)[39]。犬類中軟骨營養(yǎng)不良犬和非軟骨營養(yǎng)不良犬均會出現(xiàn)椎間盤自然退變現(xiàn)象,軟骨營養(yǎng)不良犬出現(xiàn)退變時間較非軟骨營養(yǎng)不良犬早,且軟骨營養(yǎng)不良犬椎間盤內(nèi)的脊索細胞變化、組織病理特點與蛋白多糖含量與人類較相似。靈長類中狒狒與獼猴是不錯的自發(fā)退變模型動物選擇,其活動姿勢主要為直立或半直立,在生物力學(xué)角度上是最貼近于人類椎間盤退變的模型動物。

(2)營養(yǎng)阻斷模型:椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)主要來源于上下軟骨終板以及終板外周血管,部分學(xué)者通過相應(yīng)手段阻斷椎間盤營養(yǎng)來誘發(fā)椎間盤退變。Gullbrand等[40]給新西蘭白兔喂服尼莫地平或尼古丁,通過藥物干預(yù)來研究終板內(nèi)微血管的變化。石芳芳等[41]通過結(jié)扎兔腰椎單側(cè)或雙側(cè)血管誘導(dǎo)椎間盤退變,研究表明兔腰椎間盤退變與缺血程度、缺血時間成正比。營養(yǎng)阻斷模型目前的應(yīng)用并不廣泛,主要因其操作相對復(fù)雜,造模時間較長,且部分學(xué)者對營養(yǎng)阻斷誘發(fā)退變的因素存在一定質(zhì)疑。

(3)基因敲除模型:基因敲除模型近年來成為研究的熱門方向,Beierfuss等[42]在對兔子進行APOE基因敲除后,發(fā)現(xiàn)兔子體內(nèi)的炎癥因子不斷增加,從而出現(xiàn)了椎間盤退變晚期癥狀。最近的研究中,一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的Tenomodulin(Tnmd)基因后其椎間盤出現(xiàn)了退變[43]。在早期的研究中,基因敲除模型因為成功率低、技術(shù)要求高、經(jīng)濟成本高等缺點而不被推薦。而CRISPR-Cas9這一技術(shù)出現(xiàn)后,對生化以及分子結(jié)構(gòu)研究提供新的框架[44]。使得大量且低廉的制造退變模型成為可能。基因敲除模型所表現(xiàn)出來的自然退變與人類較相似,目前有多種基因能誘發(fā)椎間盤退變,對單一基因誘發(fā)退變的情況需探討是否存在其他基因影響因素。

2.1.4 全身疾病模型

Wang等[45]將3月大的小鼠暴露于煙霧中以模擬人類長期吸煙的情況,研究發(fā)現(xiàn)小鼠椎體終板孔隙度增加,椎間盤細胞衰老加速,出現(xiàn)了蛋白聚糖水解以及MMP活性升高的情況。另一部分學(xué)者通過切除大鼠卵巢使骨質(zhì)流失,降低骨密度以誘發(fā)椎間盤退變[46]。全身疾病模型是一種研究椎間盤自然退變的方式,可控性及可重復(fù)性較差而較少應(yīng)用。

2.2 體外模型

2.2.1 體外細胞培養(yǎng)模型

近年來建立體外模型技術(shù)已較為成熟,體外細胞模型根據(jù)培養(yǎng)方式不同分為單層細胞培養(yǎng)模型與三維細胞培養(yǎng)模型。Shinmei等[47]采用單層培養(yǎng)的方式研究IL-1α對椎間盤中蛋白聚糖的影響。Gruber等[48]從人體中采集椎間盤細胞分別用單層培養(yǎng)與三維培養(yǎng)的方法進行研究,在三維培養(yǎng)中I型膠原與II型膠原含量明顯增多。相比于單層培養(yǎng)方式,三維培養(yǎng)方式能夠為細胞提供較復(fù)雜的培養(yǎng)環(huán)境,能夠一定程度上減少細胞活力喪失程度、蛋白表達不穩(wěn)定等特點。但不論單層培養(yǎng)或三維方式,均不能完全模擬真實人體環(huán)境,并且一定程度上忽略了力學(xué)等因素對椎間盤退變的影響。

2.2.2 體外器官培養(yǎng)模型

體外器官培養(yǎng)模型能夠保持椎間盤自身的穩(wěn)定性,較好的表達細胞表型。其根據(jù)是否保留椎體分為:椎間盤器官離體模型與脊柱運動節(jié)段離體模型;而椎間盤器官離體模型根據(jù)有無保留終板又分為:帶終板椎間盤器官離體模型與去終板椎間盤器官離體模型,但是否保留終板以保證椎間盤營養(yǎng)供應(yīng),不同學(xué)者之間對此存在爭議。Haschtmann等[49]認為椎間盤器官細胞活力喪失的因素在于沒有保留器官的完整性,且缺少人體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境。與之對應(yīng)的脊柱運動節(jié)段離體模型一定程度上保留了力學(xué)因素對退變的影響,更進一步的模擬了人體內(nèi)的生理環(huán)境。體外器官培養(yǎng)模型是一種新型的造模方式,但其缺點也較明顯,器官的體外培養(yǎng)不可避免的會出現(xiàn)器官、細胞活力喪失的現(xiàn)象,不利于退變模型的長期研究,且忽略了缺血、微循環(huán)障礙等因素。

3 結(jié)論

退變模型的建立方式目前已較為完善,其中自發(fā)性退變模型退變機理與人類較為相似,但自發(fā)性退變的動物種類較為局限,其體型以及椎間盤應(yīng)力方式均與人類形成差異,且構(gòu)建退變模型的要求不具有廣泛代表性;體內(nèi)模型中物理損傷模型以及應(yīng)力模型通過應(yīng)力改變來模擬人體退變環(huán)境,但其必然對實驗機體構(gòu)成損傷,且部分需通過手術(shù)的方式來改變結(jié)構(gòu)或應(yīng)力,對操作基礎(chǔ)有一定要求,且存在感染的風(fēng)險,化學(xué)損傷模型同樣存在缺乏代表性的問題;體外模型造模方式近年來逐步走向成熟,但如何解決現(xiàn)器官、細胞活力的喪失需要進一步討論研究。

總的來說,退變模型的建立主要是為了反饋于人體椎間盤退變的研究,經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者數(shù)十年的努力,椎間盤退變模型已有數(shù)十種構(gòu)建方法,這些造模方式在操作性、重復(fù)性以及經(jīng)濟性方面各有優(yōu)劣,但是由于椎間盤退變機制尚不明確,且人體與動物之間存在的實際差異,無法徹底否定任何一種造模方式,因此,在研究中不僅需要根據(jù)實際的研究目的選擇合適的動物及建模方式,更需要充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù),不斷完善動物模型的構(gòu)建,更好的為臨床服務(wù)。