豬德爾塔冠狀病毒感染對(duì)初生仔豬小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量及Hes1和MUC2表達(dá)的影響

梁繼翔，焦 哲，嚴(yán)治山，李 旸，李棟祺，劉曉麗， 谷長勤，胡薛英，程國富，張萬坡

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

小腸是仔豬食物消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所之一，腸絨毛是完成食物消化吸收的重要保障[1]。腸絨毛之間凹陷形成的隱窩結(jié)構(gòu)主要用來合成新的腸絨毛上皮細(xì)胞[1]。腸絨毛上皮細(xì)胞主要由吸收性腸細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞(goblet cell，GC)和潘氏細(xì)胞等組成[2]。覆蓋在腸上皮細(xì)胞表面的黏液層是與外來食物或病原微生物接觸的前沿[2-3]。腸黏液層主要由GC分泌產(chǎn)物構(gòu)成，所以GC對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和腸上皮細(xì)胞的完整性尤為重要[2]。當(dāng)腸道中GC缺失或分泌功能障礙往往伴發(fā)著腸道疾病[2-3]。

豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬[4]。PDCoV在中國香港首次被檢測(cè)報(bào)道之后陸續(xù)在全球多國發(fā)現(xiàn)[5-8]。臨床上PDCoV導(dǎo)致仔豬腹瀉、脫水和嘔吐等現(xiàn)象[8]。感染PDCoV的仔豬組織病理學(xué)觀察顯示小腸中絨毛萎縮、斷裂和上皮細(xì)胞變性壞死等[8-9]。腸道黏液層能及時(shí)清除外來病原微生物而對(duì)黏膜上皮細(xì)胞起到物理屏障保護(hù)作用[2,10]。腸道中由GC分泌的黏蛋白2(mucoprotein2, MUC2)是形成黏液層的主要成分之一[2]。研究表明Notch信號(hào)通路在腸道的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[11]。腸道中Notch信號(hào)通路不僅可以促進(jìn)腸黏膜上皮的增殖，而且可以調(diào)控黏膜上皮細(xì)胞的分化方向，從而調(diào)控腸黏膜上皮細(xì)胞數(shù)量與比例來適應(yīng)不同環(huán)境下腸道功能結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[11-12]。轉(zhuǎn)錄因子發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split-1，Hes1)作為Notch信號(hào)通路下游主要的靶基因決定著腸道上皮細(xì)胞的分化[2，12]。當(dāng)Hes1被激活時(shí)，腸黏膜上皮細(xì)胞向著吸收細(xì)胞系分化，影響小腸分泌細(xì)胞數(shù)量[12]。腸道中Notch信號(hào)通路的激活可以抑制GC的形成和分化[11]。目前，關(guān)于PDCoV感染初生仔豬對(duì)小腸中GC的影響鮮有報(bào)道，因此作者通過仔豬感染試驗(yàn)探究PDCoV對(duì)仔豬小腸中GC數(shù)量及Hes1和MUC2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響，以期闡明PDCoV對(duì)仔豬小腸黏膜損傷作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞系

PDCoV-CHN-HG-2017病毒株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室何啟蓋教授饋贈(zèng)。PK-15細(xì)胞(ATCC編號(hào)CCL-33)由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于PDCoV的培養(yǎng)增殖和TCID50測(cè)定。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)

湖北武漢某豬場(chǎng)購進(jìn)6頭未吃初乳的初生大白仔豬，采集所有初生仔豬的直腸拭子RT-PCR檢測(cè)PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV呈陰性。隨機(jī)將6頭 初生仔豬分為對(duì)照組(Mock組)和感染組(PDCoV組)，每組各3頭。對(duì)照組和感染組分別安置在隔離器中。每4 h給仔豬喂新鮮液態(tài)代乳品的混合物。待靜養(yǎng)48 h后給感染組仔豬口服感染5 mL 1×105TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株，對(duì)照組口服5 mL DMEM培養(yǎng)基。感染后每小時(shí)監(jiān)測(cè)一次臨床癥狀并觀察記錄，當(dāng)感染組出現(xiàn)明顯的腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀實(shí)施安樂死，并及時(shí)剖檢觀察，對(duì)仔豬十二指腸、空腸和回腸組織進(jìn)行取樣，一份置于4%甲醛溶液中固定，另一份置于-80 ℃冰箱凍存。對(duì)照組仔豬在相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇1頭實(shí)施安樂死并取材小腸樣品處理保存(同感染組仔豬)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)PDCoV

取適當(dāng)凍存的空腸組織樣品，分別采用諾唯贊生物科技有限公司RNA isolater Total RNA Extraction Reagen說明書提取組織中總RNA，用HiScript?Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于病毒的PCR檢測(cè)。參照GenBank中MF095123.1基因序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PDCoV-M引物，引物序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL：2 ×TaqMaster Mix 5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次； 72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.4 小腸組織病理學(xué)檢查和絨毛長度：隱窩深度分析

仔豬小腸組織用4%甲醛室溫固定48 h后，制備常規(guī)石蠟切片，厚4 μm。采用HE染色觀察小腸組織的病理變化。采用Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡和Image-Proplus軟件對(duì)每張組織切片選取測(cè)量結(jié)構(gòu)完整的6根絨毛長度(villus height，VH)和6個(gè)隱窩深度(crypt depth，CD)，進(jìn)行VH∶CD檢測(cè)分析。

1.5 PAS染色法和阿利新藍(lán)染色(AB)法檢測(cè)小腸中杯狀細(xì)胞

分別參照Servicebio品牌型號(hào)G1008-100ML說明書和參照Solarbio品牌型號(hào)G1560說明書對(duì)組織切片中GC進(jìn)行PAS染色和AB染色。每張組織切片通過Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡選取6個(gè)視野觀察，通過Image-Proplus計(jì)數(shù)GC數(shù)量。PAS/AB染色的每張切片分別選擇至少6個(gè)結(jié)構(gòu)完整的腸絨毛和隱窩進(jìn)行GC計(jì)數(shù)。計(jì)算PAS/AB染色GC平均數(shù)(mean number of GC)，分別比較對(duì)照組和感染組PAS/AB染色(mean number of GC)/(mean number of VH：CD)值。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)小腸中Hes1和MUC2的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

在NCBI上設(shè)計(jì)所需的引物序列并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表1)。同“1.3”的試驗(yàn)方法分別提取小腸各段總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI stepone plus)中進(jìn)行qPCR，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，檢測(cè)β-actin、Hes1和MUC2的mRNA在仔豬小腸各段中的表達(dá)水平。

1.7 ELISA法檢測(cè)仔豬小腸中Hes1和MUC2的含量

參考文獻(xiàn)[10]試驗(yàn)方法分別采用慧嘉生物技術(shù)有限公司批號(hào)202009的Porcine MUC-2 ELISA KIT和Porcine HES1 ELISA KIT試劑盒檢測(cè)小腸組織中MUC2和Hes1的含量。試驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行，在Thermo全波長酶標(biāo)儀(型號(hào)：GO)450 nm下檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算各樣本含量。

表1 引物信息表

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 PDCoV病毒檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠核酸電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶在353 bp位置，與預(yù)期擴(kuò)增片段的大小一致。從仔豬空腸組織RT-PCR檢測(cè)感染組仔豬均為陽性條帶，對(duì)照組仔豬均為陰性條帶，則感染組仔豬成功接種PDCoV(圖1)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； N. 陰性對(duì)照； 1～3. 感染組仔豬空腸組織樣； 4～6. 對(duì)照組仔豬空腸組織樣 M. DL2000 DNA marker; N. Negative control; 1-3. Jejunum tissue of infected piglets; 4-6. Jejunum tissue of control group圖1 PDCoV的RT-PCR檢測(cè)電泳圖Fig.1 Detection of PDCoV by RT-PCR

2.2 小腸組織病理學(xué)檢查

仔豬小腸組織HE染色觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組仔豬的十二指腸結(jié)構(gòu)完整，無炎癥反應(yīng)；空腸褶皺結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛較長；回腸結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛較長，派爾結(jié)發(fā)育正常(圖2 A～C)。感染組仔豬的十二指腸絨毛萎縮，固有層和黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤；空腸絨毛嚴(yán)重萎縮變鈍，絨毛上皮細(xì)胞脫落，上皮細(xì)胞變性壞死，固有層充血；回腸絨毛嚴(yán)重萎縮、斷裂，固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤(圖2 D～F)。

2.3 小腸各段絨毛長度和VH∶CD值

感染組仔豬小腸各段腸絨毛長度、腸絨毛長度與隱窩深度比值(VH∶CD)相對(duì)于對(duì)照組仔豬均降低，且差異顯著(P<0.05)。

2.4 仔豬小腸組織中杯狀細(xì)胞的PAS染色

仔豬小腸中的GC經(jīng)PAS染色呈紫紅色(中性黏蛋白)，主要分布在腸絨毛和隱窩中，感染組仔豬小腸各段陽性信號(hào)均低于對(duì)照組仔豬(圖3 A～F)。小腸各段GC計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，感染組仔豬小腸各段均低于對(duì)照組，差異顯著(P<0.001)(圖3 G～I(xiàn))。

2.5 仔豬小腸組織中杯狀細(xì)胞的AB染色

仔豬小腸中的GC由AB染色呈藍(lán)色(酸性黏蛋白),主要分布在腸絨毛上皮和隱窩中，與PAS染色結(jié)果一致，感染組仔豬小腸各段陽性信號(hào)均低于對(duì)照組仔豬(圖4 A～F)。小腸各段GC計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，感染組仔豬小腸各段均低于對(duì)照組仔豬，十二指腸(P<0.01)、空腸(P<0.05)和回腸(P<0.001) 差異顯著(圖4 G～I(xiàn))。

2.6 小腸組織各段平均單個(gè)腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量

由PAS染色和AB染色的小腸組織，各段平均單個(gè)腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量顯示感染組仔豬小腸各段均低于對(duì)照組仔豬，且差異顯著(P<0.05)。

A～C. 對(duì)照組小腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果; D～F. 感染組小腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果 A-C. Histopathological observation results of small intestine in control group; D-F. Histopathological observation results of small intestine in infection group圖2 仔豬小腸組織病理學(xué)變化Fig.2 Histopathological changes in small intestine of piglets

表2 小腸各段腸絨毛長度與VH∶CD值

2.7 小腸各段組織中GC平均數(shù)與VH∶CD平均值的比值

參照文獻(xiàn)[3]方法對(duì)小腸各段組織GC的平均數(shù)(表3)與對(duì)應(yīng)的小腸各段VH平均值∶CD平均值(表2)的比值(表4)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示感染組仔豬均低于對(duì)照組仔豬。采用PAS染色結(jié)果顯示，対照組仔豬小腸各段分別為3.98、3.21、11.58，感染組仔豬小腸各段分別為3.76、2.07、6.56。采用AB染色結(jié)果顯示，對(duì)照組仔豬小腸各段分別為4.55、3.70、11.79，感染組仔豬小腸各段分別為3.02、3.03、8.88。

2.8 小腸各段組織中Hes1和MUC2 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量

結(jié)果顯示，感染組仔豬與對(duì)照組仔豬相比小腸各段Hes1 mRNA水平表達(dá)均有不同程度的升高，在空腸(P<0.01)和回腸(P<0.05)中升高明顯差異顯著，十二指腸(P>0.05)中無顯著差異(圖5A)。感染組仔豬與對(duì)照組仔豬相比小腸各段MUC2 mRNA水平表達(dá)均有不同程度降低，在十二指腸(P<0.05)和回腸(P<0.001)中降低明顯差異顯著，空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖5B)。

2.9 PDCoV對(duì)初生仔豬小腸組織中Hes1和MUC2含量的影響

結(jié)果顯示，感染組仔豬與對(duì)照組仔豬相比十二指腸、空腸和回腸組織中Hes1含量均升高，在十二指腸(P<0.01)和回腸(P<0.01)中升高明顯差異顯著，在空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖6 A)。感染組仔豬與對(duì)照組仔豬相比十二指腸、空腸和回腸組織中MUC2含量均降低，在十二指腸(P<0.01)和回腸(P<0.05)中降低明顯差異顯著，在空腸(P>0.05)中無顯著差異(圖6 B)。

A～F. 杯狀細(xì)胞在各組小腸各段AB染色結(jié)果； G～I(xiàn). AB染色結(jié)果在各組小腸各段陽性率分析；*.P<0.005; **.P<0.01; ***.P<0.001 A-F. AB staining results in small intestine of per group; G-I. The positive rate of AB staining in each segment of small intestine was analyzed；*.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001圖4 仔豬小腸組織杯狀細(xì)胞AB染色結(jié)果及陽性率Fig.4 AB staining results and positive rate of goblet cells in small intestine of piglets

表3 小腸組織各段平均單個(gè)腸絨毛和隱窩中GC數(shù)量

表4 對(duì)照組和感染組(mean number of GC)/(mean number of VH：CD)值

A. 用qPCR檢測(cè)小腸各段Hes1的mRNA相對(duì)表達(dá); B. 用qPCR檢測(cè)小腸各段MUC2的mRNA相對(duì)表達(dá); *.P<0.05; **.P<0.01；***.P<0.001 A. Relative expression of Hes1 mRNA was detected by qPCR; B. Relative expression of MUC2 mRNA was detected by qPCR; *.P<0.05; **.P<0.01；***.P<0.001圖5 Hes1(A)和MUC2(B)的基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)Fig.5 Detection of Hes1 (A) and MUC2 (B) genes transcription

A. 用ELISA檢測(cè)小腸各段Hes1含量; B. 用ELISA檢測(cè)小腸各段MUC2含量; *P<0.05; **.P<0.01 A. The content of Hes1 in small intestine was detected by ELISA; B. The content of MUC2 in small intestine was detected by ELISA; *P<0.05; **.P<0.01圖6 仔豬小腸各段組織中Hes1(A)和MUC2(B)含量Fig.6 The content of Hes1 (A) and MUC2 (B) in small intestine of piglets

3 討 論

Zhang等[13]從腹瀉的哺乳仔豬糞便中分離出PDCoV-CHN-HG-2017病毒株，并通過口服10 mL 1×106TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株感染5日齡的仔豬驗(yàn)證了病毒的致病性。本次試驗(yàn)對(duì)未吃初乳的初生仔豬口服感染5 mL 1×105TCID50·mL-1PDCoV-CHN-HG-2017毒株觀察到的臨床癥狀為腹瀉、脫水和嗜睡，這與之前的研究結(jié)果相符[8,13-14]。Ma等[15]和Jung 等[16]對(duì)10～19日齡的仔豬感染PDCoV，24 h后觀察到仔豬腹瀉，并在直腸拭子中檢測(cè)到PDCoV。Zhang等[13]在PDCoV感染5日齡仔豬1 d后觀察到腹瀉癥狀，并通過RT-qPCR檢測(cè)了不同組織中病毒的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)空腸組織中相對(duì)較高。本試驗(yàn)對(duì)仔豬空腸組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在22 hpi時(shí)呈陽性結(jié)果，這與之前報(bào)道相一致，表明初生仔豬感染試驗(yàn)成功。Dong等[17]發(fā)現(xiàn)5日齡仔豬感染PDCoV后1 d有4/8出現(xiàn)臨床癥狀，21日齡仔豬感染同等劑量PDCoV后1 d有1/5出現(xiàn)臨床癥狀。Zhang等[13]在5日齡仔豬感染PDCoV后1 d觀察到腹瀉癥狀，在2～6 dpi觀察到更嚴(yán)重的臨床癥狀。本研究中初生仔豬分別在22、39和70 hpi出現(xiàn)明顯腹瀉、脫水和嗜睡等臨床癥狀，這可能與仔豬之間的個(gè)體差異和本次試驗(yàn)感染病毒劑量有關(guān)。小腸組織病理學(xué)研究結(jié)果顯示感染組仔豬與對(duì)照組相比，十二指腸絨毛萎縮，空腸絨毛嚴(yán)重萎縮變鈍，上皮細(xì)胞變性壞死，固有層充血，回腸絨毛嚴(yán)重萎縮，大量淋巴細(xì)胞浸潤，這與之前的試驗(yàn)結(jié)果相符[9,13,16]。小腸是仔豬重要的食物消化吸收?qǐng)鏊?，其豐富完整的腸絨毛與隱窩結(jié)構(gòu)分別增加了腸道的有效吸收面積與絨毛上皮細(xì)胞的更換速率[1]。所以VH和VH∶CD值是用來衡量小腸黏膜功能完整性的重要指標(biāo)[18]。本次試驗(yàn)PDCoV感染仔豬引起小腸各段腸絨毛萎縮且差異顯著，感染組仔豬小腸各段的VH∶CD值均降低且差異顯著，導(dǎo)致感染組仔豬小腸的吸收和屏障功能下降，進(jìn)而出現(xiàn)腹瀉和脫水現(xiàn)象。

腸黏膜上皮細(xì)胞往往是抵御外來病原體的第一道防線，在機(jī)體先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要的作用[2]。黏液層覆蓋在腸黏膜上皮細(xì)胞表面能及時(shí)地清除外來病原體，對(duì)腸道具有潤滑和屏障作用[2,10]。GC分泌的多種因子在維持腸道組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用，這些因子都有助于黏液層保護(hù)黏膜上皮細(xì)胞[2]。本試驗(yàn)對(duì)小腸組織中GC進(jìn)行PAS染色(中性黏蛋白)和AB染色(酸性黏蛋白)結(jié)果一致，感染組仔豬在小腸各段GC數(shù)量均不同程度低于對(duì)照組仔豬且差異顯著。這與Jung 等[3]對(duì)9日齡仔豬接種PEDV后引起空腸中GC數(shù)量顯著降低相似。Jung等[3]研究發(fā)現(xiàn)PEDV感染組仔豬和對(duì)照組仔豬空腸中GC的平均數(shù)與VH平均值∶CD平均值的比值，在感染后1 d分別為0.3(AB)/0.4(PAS)和2.3(AB)/2.5(PAS)，在感染后3 d分別為0.9(AB)/1.7(PAS)和2.6(AB)/3.0(PAS)，證明GC數(shù)量減少明顯與PEDV感染相關(guān)。本試驗(yàn)比較分析了小腸各段組織切片GC的平均數(shù)與小腸各段的VH平均值∶CD平均值的比值，發(fā)現(xiàn)感染組仔豬與對(duì)照組相比在空腸和回腸減少明顯(表4)，這與Jung 等[3]的研究相似。表明PDCoV感染仔豬在空腸和回腸中對(duì)GC影響很大，這與研究報(bào)道PDCoV主要定位在空腸與回腸相符合[13-14]。Jung 等[3]通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)PEDV發(fā)現(xiàn)部分陽性信號(hào)位于GC中。但本試驗(yàn)感染組仔豬數(shù)量偏少，且未通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)PDCoV在小腸各段的分布現(xiàn)象，所以是否PDCoV可以直接侵襲GC進(jìn)而對(duì)GC的形成和分泌產(chǎn)生影響還需要試驗(yàn)探討。

小腸的黏液層主要由GC分泌的MUC2、水和無機(jī)鹽等構(gòu)成[19]。腸道致病微生物進(jìn)入機(jī)體往往伴發(fā)著MUC2結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量的改變，當(dāng)黏液層變薄時(shí)外來病原體就可以直接侵襲腸上皮細(xì)胞導(dǎo)致炎癥或免疫反應(yīng)等[10,19]。張麗霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)牛源致病性大腸埃希菌K99感染小鼠后6～60 h小腸各段組織中的GC數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，引起小腸黏膜上皮的損傷。吳異健等[21]研究發(fā)現(xiàn)番鴨呼腸孤病毒感染1日齡雛番鴨后在1～21 d小腸各段組織中GC數(shù)量均降低，引起腸道消化吸收功能障礙。王譽(yù)穎等[22]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌可以提高腹瀉大鼠回腸中GC數(shù)量和促進(jìn)MUC2的合成，進(jìn)而減輕腹瀉對(duì)大鼠腸道黏膜的損傷。朱春洋等[23]研究發(fā)現(xiàn)四逆散可通過增加功能消化不良大鼠十二指腸中GC數(shù)量和MUC2的表達(dá)改善黏液屏障,從而起到治療功能消化不良作用。Notch信號(hào)通路是一條依賴于細(xì)胞間相互接觸傳遞的保守信號(hào)通路，在動(dòng)物發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用[12]。研究表明腸道中激活Notch信號(hào)通路可調(diào)控腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖與分化，轉(zhuǎn)錄因子Hes1可作為Notch信號(hào)通路下游的靶基因抑制GC的分化[11-12]。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)在LS174T細(xì)胞中通過RNA干擾下調(diào)numb基因可激活Notch信號(hào)通路，上調(diào)Hes1表達(dá)。在LS174TI細(xì)胞中敲除numb基因可降低MUC2蛋白的表達(dá)和喪失杯狀細(xì)胞表型分化[24]。本研究中PDCoV感染初生仔豬引起小腸各段組織Hes1 mRNA轉(zhuǎn)錄量和Hes1含量均升高，推測(cè)PDCoV感染仔豬激活小腸中Hes1的表達(dá)導(dǎo)致GC分化受到抑制，降低了小腸中GC數(shù)量，這與PAS染色和AB染色結(jié)果相對(duì)應(yīng)。感染組仔豬與對(duì)照組相比小腸各段組織MUC2 mRNA轉(zhuǎn)錄量和MUC2含量均降低，這可能與PDCoV感染仔豬減少小腸組織中GC數(shù)量有關(guān)。

4 結(jié) 論

PDCoV感染初生仔豬引起小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少。原因可能是PDCoV激活了腸道Notch信號(hào)通路，使下游靶基因Hes1表達(dá)升高，抑制杯狀細(xì)胞的形成和分化，導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量減少和MUC2表達(dá)降低。