利用N糖苷酶F對單克隆抗體N糖酶解條件的優(yōu)化

張博慧, 賈戴輝, 程倩, 許俊彥, 邵喆, 黃應峰

寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司藥物分析部門, 上海 201203

N糖基化修飾是單克隆抗體藥物普遍存在的翻譯后修飾現象。目前研究表明，糖基化修飾與單克隆抗體藥物的功能、藥物代謝、免疫原性等關系密切[1-3]，如核心巖藻糖缺失能顯著增強ADCC效應[4]，半乳糖能夠增強CDC活性[5]；末端N-乙酰葡萄糖影響抗體藥物半衰期[6-7]；唾液酸化糖型具有抗炎癥功能[8]；α(1-3)半乳糖和NGNA型唾液酸易引起免疫原性[9]等。N糖對抗體結構也具有重要作用，能穩(wěn)定CH2結構域，去糖抗體穩(wěn)定性會變差，更易發(fā)生去折疊和聚集[10]。

N糖類型和含量受細胞株、培養(yǎng)條件、純化和儲存[11-13]等過程的影響，因此在單抗藥物細胞篩選、工藝優(yōu)化、純化、產品放行和穩(wěn)定性考察中控制和監(jiān)測N糖含量，保證單抗藥物安全性、有效性等尤為重要。目前檢測N糖的方法主要有親水色譜-熒光法[14]、CE-LIF法[15-16]和質譜法[17-18]等。其中親水色譜-熒光法是目前應用最為廣泛的方法，該方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的N糖鏈，再用標記試劑進行衍生化，采用親水色譜柱分離，熒光檢測器檢測。由于PNGase F幾乎能水解所有哺乳動物細胞產生的N糖，因此得到廣泛應用[19]。傳統(tǒng)的N糖譜檢測方法一般耗時較長，目前快速N糖樣品制備的試劑盒已經商品化，大幅提高了N糖的檢測效率，但是通常價格昂貴。而應用快速PNGase F酶與傳統(tǒng)制備過程相組合成為提高檢測效率和降低檢測成本的一種選擇。本研究基于親水色譜-熒光法，針對PNGase F水解條件進行了優(yōu)化，發(fā)現和解決了酶解過程中易對結果產生影響的一些因素，建立了高效準確的N糖檢測方法，以期為N糖的檢測研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試品 本研究所用mAb1、mAb2和mAb2-F均為寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司生產的IgG1型單克隆抗體。

1.1.2試劑和耗材 N糖苷酶F(PNGase F)、快速PNGase F酶(rapid PNGase F)及變性緩沖液(5×)均購自New England BioLabs公司；無水乙醇、甲酸銨、乙酸、二甲基亞砜(DMSO)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氫化鈉、β-巰基乙醇等均購自Sigma公司；甲酸和乙腈購自Fisher公司；PBS Buffer(1×)購自上海生工；10 kD超濾離心管購自Merck公司；100 mmol·L-1Tris-HCl(含1% SDS，pH 9.0)溶液和非涂層-熔融石英毛細管購自Beckman公司；純化柱(GlycoCleanTMS Cartridges)購自Prozyme公司；色譜柱ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)購自Waters公司；色譜柱AdvanceBio Glycan Mapping Column(2.7 μm，4.6 mm×150 mm)購自Agilent公司。

1.1.3主要儀器設備 高效液相系統(tǒng)(HPLC，1260)購自Agilent公司；超高效液相系統(tǒng)(UPLC，H-Class Plus)購自美國Waters公司；液質聯用系統(tǒng)(LC-MS，Q Exactive)和數據處理軟件(Biopharma Finder)均購自美國Thermo公司；毛細管電泳儀(CE，PA800 Plus)購自Beckman公司；真空離心濃縮干燥儀(RVC 2-25)購自德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1蛋白沉淀和N糖衍生化 向酶解后的樣品中加入3倍體積的冰乙醇，-15～-25℃放置約1 h，高速離心10 min，取上清干燥。加入10 μL 2-AB衍生化試劑，65℃避光孵育3 h。用純化柱純化后干燥，50%乙腈復溶，準備上機分析。

1.2.2HPLC色譜條件 儀器采用高效液相系統(tǒng)(Agilent，1260)；色譜柱采用Advance Bio Glycan Mapping Column；流動相A為100 mmol·L-1甲酸銨(pH 4.5)，流動相B為100%乙腈；進樣量2 μL；流速0.5 mL·min-1；熒光檢測器激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長430 nm；色譜柱溫度55℃；梯度洗脫。

1.2.3UPLC色譜條件 儀器采用超高效液相系統(tǒng)(Waters，H-class plus)，色譜柱采用ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column。流動相A為100 mmol·L-1甲酸銨(pH 4.5)，流動相B為100%乙腈，進樣量2 μL，流速0.5 mL·min-1，熒光檢測器激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長420 nm，色譜柱溫度60℃，梯度洗脫。

1.2.4質譜參數 應用液質聯用系統(tǒng)(LC-MS，Q Exactive)的HESI正離子模式(HESI+)，離子源的溫度和電壓分別為320℃和3.8 kV，離子傳輸管溫度為200℃，其他儀器參數設置均經過優(yōu)化以獲得最佳信號響應；母離子掃描范圍700～3 000 m·z-1，分離度15 000，分析時長60 min；數據處理軟件采用Biopharma Finder。

1.2.5還原毛細管凝膠電泳(R CE-SDS) 將蛋白沉淀用100 mmol·L-1Tris-HCl(含1% SDS，pH 9.0)溶液復溶，加入β-巰基乙醇還原。儀器采用毛細管電泳儀(Beckman，PA800 plus)，毛細管采用非涂層-熔融石英毛細管，PDA檢測器，波長220 nm，電動進樣(-5 kV)20 s，電壓分離(-15 kV)40 min。

2 結果與分析

2.1 緩沖液pH對結果的影響

分別將mAb1和mAb2樣品調pH至4、5、6和7，取200 μg進行PNGase F酶解24 h，檢測N糖含量。實驗結果如表1和圖1所示，mAb2在不同pH緩沖液酶解的N糖含量高度一致，說明pH對該樣品N糖水解無影響；而mAb1中N糖含量隨pH的變化出現明顯差異，其中緩沖液pH為4時，峰2(p2)含量出現大幅度升高，相應的峰3(p3)含量明顯下降，pH 6和7條件下N糖含量基本一致。

表1 mAb1和mAb2在不同pH緩沖液中酶解的N糖含量Table 1 N-glycan content of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in different pH buffer

圖1 mAb1和mAb2在不同pH緩沖液中酶解的N糖色譜圖Fig.1 N-glycan chromatogram of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in different pH buffer

將mAb1不同pH酶解后的蛋白進行還原CE-SDS檢測，結果(圖2)顯示含N糖重鏈(HC)基本已被酶解成非糖基化重鏈(NG HC)，說明不同pH緩沖液下PNGase F酶解N糖24 h后均酶解完全，N糖含量的變化并非不完全酶解造成。

利用液質聯用鑒定各N糖的種類，p2和p3分別為G0F-GN(A1F)和G0F(A2F)。通過比較不同時間(1、8和24 h)酶解結果(表2)，發(fā)現緩沖液pH為4和5時，p2和p3含量的變化隨著酶解時間的增加而呈梯度變化，pH 4時尤為明顯；pH為6和7時，變化不明顯。因此推測在某些單抗分子上，G0F上的N-乙酰氨基葡萄糖在低pH條件下易從N糖鏈上脫落，使G0F形成G0F-GN，從而引起G0F-GN和G0F含量的變化。因此在進行PNGase F酶解時，應避免酶解體系中pH過低。

圖2 mAb1不同pH酶解蛋白R CE-SDS電泳圖Fig.2 Reduced CE-SDS of deglycoprotein from mAb1 hydrolyzed in different pH buffer

表2 mAb1在不同pH緩沖液中酶解不同時間的N糖含量Table 2 N-glycan content of mAb1 hydrolyzed in different pH buffer at different times

2.2 置換緩沖液的選擇

為避免樣品緩沖液pH及成分對PNGase F酶解的影響，用超濾離心管將樣品換液至合適的溶液中再進行PNGase F酶解。本研究選擇了1×PBS溶液(pH 7.4)和超純水分別置換mAb1和mAb2的樣品緩沖液，以未置換緩沖液(pH 7)為對照，PNGase F酶解24 h，進行N糖譜檢測。N糖色譜圖和含量分別見表3和圖3，結果表明1×PBS溶液、超純水和樣品緩沖液(pH 7)的N糖譜結果一致。因為蛋白在超純水中穩(wěn)定性較差，所以本研究選用1×PBS溶液(pH 7.4)置換樣品的緩沖液。

表3 mAb1和mAb2在樣品緩沖液、1×PBS和超純水中的N糖含量Table 3 N-glycan content of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in sample buffer, 1×PBS and water

圖3 mAb1和mAb2在樣品緩沖液、1×PBS和超純水中的N糖色譜圖Fig.3 N-glycan profiles of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in sample buffer, 1×PBS and water

2.3 不同PNGase F酶對N糖結果的影響

直接取200 μg樣品，分別加入快速PNGase F酶(rapid PNGase F)和PNGase F進行酶解，N糖譜如圖4所示。結果顯示用rapid PNGase F進行酶解時，若選擇用UPLC和1.7 μm粒徑的ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column色譜柱，則由于分離度的提高，mAb2的N糖色譜圖(圖4B)中G0F和G1Fa出現肩峰，而HPLC結果(圖4A)由于分離度較差，此峰未得到有效分離。當將mAb2樣品緩沖液置換至1×PBS中時(圖4C)，該肩峰消失。

A：mAb2未置換緩沖液HPLC檢測；B：mAb2未置換緩沖液UPLC檢測；C：mAb2置換緩沖液UPLC檢測。圖4 不同PNGase F的N糖譜結果Fig.4 N-glycan profiles of mAb2 hydrolyzed by different PNGase F

綜合2.1～2.3部分的研究結果可知，將樣品置換緩沖液至合適的溶液中再進行PNGase F酶解，對改善N糖譜峰形和結果準確度至關重要，本研究采用了1×PBS溶液，效果良好。另外，在置換緩沖液的基礎上使用快速PNGase F能將酶解時間縮短為數十分鐘，有效提高了檢測效率。選擇UPLC能有效提高分辨率。

2.4 蛋白變性對酶解效率的影響

本研究發(fā)現，在非變性條件下利用快速PNGase F酶解不同單抗所需酶解時間差異明顯，從數分鐘至數小時不等。為了有效提高酶解效率，選擇所需酶解時間最長的mAb2-F置換緩沖液至1×PBS中，加入變性緩沖液(5×)和1 μL rapid PNGase F酶，50℃孵育10 min后進行N糖譜檢測處理，將沉淀的蛋白進行還原 CE-SDS檢測，以未加變性緩沖液(5×)樣品為對照。由圖5還原CE-SDS結果可知，相同的酶解時間條件下，蛋白變性后由于高級結構被破壞，N糖充分暴露與酶接觸，所以其酶解效果更好。

2.5 酶解程度對N糖結果的影響

在非變性條件下加入不同體積的rapid PNGase F酶對mAb2-F進行N糖譜檢測處理，將沉淀的蛋白進行還原 CE-SDS檢測，以加入變性緩沖液(5×)和1 μL rapid PNGase F酶的樣品為對照，酶解條件均選擇50℃、10 min。由圖6(左)可知，在非變性條件下酶解相同時間，酶量的增加使非糖基化組分增多，但酶量增加至2 μL時酶解效果仍較差，而變性條件下用1 μL rapid PNGase F酶解，糖基化組分基本被轉換成非糖基化組分。N糖水解的程度不同，N糖含量(表4)明顯成梯度變化,說明PNGase F對不同類型的N糖水解效率不同，因此為了獲得樣品中真實的N糖含量水平，應將N糖盡量酶解完全。

圖5 mAb2-F在變性和非變性條件下切糖后還原CE-SDS圖譜Fig.5 R CE-SDS profiles of mAb2-F deglycated in nature and denature conditions

表4 不同體積rapid PNGase F酶解mAb2-F的N糖含量Table 4 N-glycan content of mAb2-F deglycated by different rapid PNGase F amount

3 討論

N糖檢測結果的準確性受多種因素的影響。在緩沖液pH對PNGase F酶解的影響研究中發(fā)現，低pH能使某些單抗在酶解過程中G0F逐漸轉化為G0F-GN，造成檢測結果的嚴重偏差，這種情況通常出現在Protein A親和純化后的樣本，在低pH洗脫后直接進行酶解，若先將樣品緩沖液pH調至中性或進行換液處理，能夠避免pH的影響。對照mAb2置換和未置換樣品緩沖液酶解結果，置換緩沖液能有效消除G0F和G1Fa的肩峰，消除樣品緩沖液成分對檢測結果的影響。

另外，本研究對多種單抗的研究發(fā)現，酶解程度不同的N糖檢測結果存在明顯差異，說明N糖苷酶F對不同類型的N糖水解效率不同，這與已有文獻報道[20]一致。因此為了獲得樣品中真實的N糖含量水平，應將N糖盡量酶解完全。酶解程度可采用將蛋白沉淀進行還原CE-SDS檢測，觀察非糖基化組分含量的變化情況。

在細胞株篩選和工藝優(yōu)化階段，快速、準確的N糖檢測結果能夠有效推進開發(fā)進度，而該階段巨大的樣本量又對成本控制提出更高的要求，因此建立一種高效、準確且低成本的N糖檢測方法尤為重要。本研究確定了較為通用的PNGase F酶對單克隆抗體的酶解條件，即為將樣品置換緩沖液至1×PBS，取適量樣品加入變性緩沖液(5×)和1 μL Rapid PNGase F酶，50℃孵育10 min，進行后續(xù)除蛋白、干燥等處理，快速PNGase F酶和變性處理的應用，將酶解時間大幅縮短，提高了檢測效率；同時采用傳統(tǒng)的UPLC和ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column色譜柱，有效提高了分離度，并控制了檢測成本。

圖6 不同體積rapid PNGase F酶解mAb2-F的R CE-SDS和N糖譜圖Fig.6 N-glycan and R CE-SDS profiles of mAb2-F deglycated by different rapid PNGase F amount