黑曲霉固態(tài)發(fā)酵涼茶渣產(chǎn)酶工藝研究

袁明貴，向蓉，馬廣宇，彭新宇，田雅，周廷斤，徐志宏，3*，祁振寬

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心，廣東 肇慶 526238；4.清遠(yuǎn)加多寶草本植物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511675）

中國主流的飲用性涼茶是由雞蛋花、金銀花、菊花、涼粉草、夏枯草、甘草和布渣葉共7種植物藥物煎制而成。近年來，隨著涼茶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，涼茶渣的排放在逐年增加，日產(chǎn)量達(dá)到680 t[1]。目前國內(nèi)對涼茶渣的資源化利用研究比較缺乏，僅在直接作為飼料添加劑或生物質(zhì)能源方面有少量的報道[1-2]，大量的涼茶渣依然采用直接堆放、填埋或焚燒等方式處理，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、木聚糖和果膠組成，共同保護(hù)細(xì)胞免受傷害，同時也阻礙了動物對營養(yǎng)的消化利用。纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶可以將對應(yīng)的大分子底物降解成單糖或寡糖，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和活性物質(zhì)的釋放[3]，為動物提供易于消化吸收的糖類化合物[4]，因此，纖維素酶[5-6]、果膠酶[7-9]和木聚糖酶[10-12]在食品、飼料等工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。由于木聚糖酶和果膠酶的存在能夠更好地促進(jìn)纖維素酶降解底物[13]，因此，發(fā)酵產(chǎn)物中不進(jìn)行分離的纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力的高低也代表了菌株轉(zhuǎn)化利用植物細(xì)胞的能力[4]。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見的無毒性曲霉屬真菌[14]，發(fā)酵后能夠產(chǎn)生多種生物酶[15-17]。因此，探索以黑曲霉為菌種發(fā)酵涼茶渣生產(chǎn)纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶等生物酶的廉價工藝，具有一定的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶的重要組成之一，本文擬通過單因素試驗和正交試驗，研究利用黑曲霉發(fā)酵涼茶渣生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最佳工藝，為涼茶渣的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉GIM3.562：廣東省微生物菌種保藏中心；涼茶渣：清遠(yuǎn)加多寶草本植物科技有限公司。

3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：Ruibio公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）：Aladdin公司；果膠、D-木糖（優(yōu)級純）：華邁科公司；D-一水半乳糖醛酸（分析純）：Fluka公司；木聚糖（分析純）：Sigma公司；其余試劑均分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5804R高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；XS205DU電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；LDZX-50KB立式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BHC-1300IIA2生物安全柜、Elx50酶標(biāo)儀：BioTek Instruments公司；BME生物顯微鏡：上海萊卡公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g去皮，切成塊，煮沸30 min，紗布過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補(bǔ)水至1 000 mL，然后121℃濕熱滅菌20 min。

固態(tài)涼茶渣培養(yǎng)基：將新鮮涼茶渣曬干粉碎，取粉末2 g，加入硫酸銨0.08 g，葡萄糖0.04 g，磷酸二氫鉀0.01 g，磷酸氫二鉀0.008 g，水8 g，121℃濕熱滅菌20 min，滅菌后 pH 值為 5.03±0.01。

1.3 方法

在80%濕度，30℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，利用PDA平板培養(yǎng)基將黑曲霉培養(yǎng)120 h，連續(xù)傳代兩次。制備黑曲霉孢子懸液，利用血球板計數(shù)法，調(diào)節(jié)孢子濃度為2×109CFU/mL，將菌種按照10%接種量接種至固態(tài)涼茶渣培養(yǎng)基中，然后按照各部分設(shè)定的試驗條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1 單因素試驗

分別考察氮源種類（尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕和無補(bǔ)充氮源）、碳源種類（葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和無補(bǔ)充碳源）、含水量（65%～85%）、發(fā)酵時間（48h～144h）、浸泡液 pH 值（5.00～9.00）、溫度（28℃～37℃和室溫25℃）共6個因素對內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的活力影響。在單因素試驗、正交試驗以及驗證試驗中除特別說明外，培養(yǎng)基成分不變，硫酸銨含量、葡萄糖含量、含水量以及接種量均按涼茶渣的干重計算。

1.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶的酶活力權(quán)重均設(shè)定為1，以3種酶的活力總和作為考察指標(biāo)，對含水量A、浸泡液pH值B、發(fā)酵溫度C、發(fā)酵時間D共4個因素進(jìn)行三水平正交試驗優(yōu)化，各因素水平見表1。

1.3.3 酶活力測定

發(fā)酵結(jié)束后，向三角瓶中加入15 mL生理鹽水，振蕩后過夜；經(jīng)過5 000 r/min離心10 min，采用DNS顯色法檢測上清液中內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶活力[4，18]；沉淀烘干后即為發(fā)酵樣品干重。

1.3.3.1 酶活力測定方法

取底物溶液0.4 mL，發(fā)酵上清液0.1 mL，混勻后，40℃水浴進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min；然后加入DNS 0.5 mL，再次混勻后，沸水浴10 min，以蒸餾水代替底物溶液為對照，測定特定波長吸光度，計算酶活力。

用0.2 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.0），配制6.25 mg/mL羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用終濃度0、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定530 nm的吸光度，計算內(nèi)切葡聚糖酶活力[13]；用0.2 mol/L的磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH 5.0），配制0.5%的果膠溶液為底物，用終濃度0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL 的 D-半乳糖醛酸制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定540 nm的吸光度，計算果膠酶活力[19]；用與配制果膠溶液相同的方法，配制0.5%的木聚糖溶液為底物，用終濃度 0、100、200、300、400、500、600 μg/mL的D-木糖制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定550 nm的吸光度，計算木聚糖酶活力[20]。

1.3.3.2 酶活力計算

規(guī)定：某種酶在40℃時，每分鐘產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物的酶量為1個酶活力單位（U）。

酶活力計算公式如下。

式中：C0根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得的酶促反應(yīng)前還原糖濃度，μmol/mL；C1酶促反應(yīng)后還原糖濃度，μmol/mL；V1參與反應(yīng)的酶溶液體積，mL；V2酶溶液總體積，mL，包括發(fā)酵前培養(yǎng)基含水量，加入菌種以及調(diào)節(jié)pH值引入的水分，和發(fā)酵后加入的生理鹽水；t酶促反應(yīng)時間，min；m 發(fā)酵樣品干重，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21軟件對單因素試驗中的同一種酶活力進(jìn)行方差分析。以P＜0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)；以P＜0.01作為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)。所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 氮源種類對酶活力的影響

以2%葡萄糖為碳源，含水量為80%，分別向涼茶渣培養(yǎng)基中添加4%尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕和無補(bǔ)充氮源，31℃發(fā)酵72 h，考察氮源種類對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響見圖1。

圖1 氮源種類對酶活力的影響Fig.1 Effects of nitrogen sources on enzyme activity

從圖1可以看出，內(nèi)切葡聚糖酶活力按照無補(bǔ)充氮源、豆粕、氯化銨（或尿素）、硫酸銨的順序極顯著增加（P＜0.01），其中氯化銨和尿素對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05）；硫酸銨對應(yīng)的果膠酶活力極顯著高于尿素、氯化銨、豆粕和無補(bǔ)充氮源對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.01），其中尿素、氯化銨、豆粕對應(yīng)的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是尿素對應(yīng)的果膠酶活力顯著高于無補(bǔ)充氮源對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.05）；硫酸銨對應(yīng)的木聚糖酶活力極顯著高于尿素和氯化銨的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中尿素和氯化銨的木聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是極顯著高于豆粕和無補(bǔ)充氮源對應(yīng)的酶活力（P＜0.01）。因此4%硫酸銨是黑曲霉發(fā)酵涼茶渣的適宜氮源。

2.1.2 碳源種類對酶活力的影響

以4%硫酸銨為氮源，含水量為80%，向涼茶渣培養(yǎng)基中分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和無補(bǔ)充碳源，31℃發(fā)酵72 h，考察碳源種類對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 碳源種類對酶活力的影響Fig.2 Effects of carbon source on enzyme activity

從圖2可以看出，葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是均極顯著高于α-乳糖和無補(bǔ)充碳源對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應(yīng)的果膠酶活力極顯著高于α-乳糖和無補(bǔ)充碳源對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.01），其中蔗糖和葡萄糖對應(yīng)的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是蔗糖對應(yīng)的果膠酶活力顯著高于糖蜜對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.05）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應(yīng)的木聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是均極顯著高于無補(bǔ)充碳源對應(yīng)的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中葡萄糖和蔗糖對應(yīng)的木聚糖酶活力顯著高于α-乳糖對應(yīng)的木聚糖酶活力（P＜0.05）。α-乳糖對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶和果膠酶活力顯著低于無補(bǔ)充碳源的酶活力（P＜0.05），而且對應(yīng)的木聚糖酶活力與無補(bǔ)充碳源的酶活力無顯著差異（P>0.05）。綜上所述，2%葡萄糖是黑曲霉發(fā)酵涼茶渣的較優(yōu)碳源。

2.1.3 含水量對酶活力的影響

基質(zhì)的含水量影響著胞外酶的分泌和轉(zhuǎn)移，影響菌體生長。一般來說真菌發(fā)酵時需要相對更低的含水量，如利用黑曲霉對三七渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料時，含水量為60%[21]；利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料時，含水量可以低至50%[22]。在本試驗中，向涼茶渣培養(yǎng)基補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，31℃發(fā)酵72 h，考察65%～85%含水量范圍對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，65%和70%含水量對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），75%、80%和85%含水量對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是65%和70%含水量對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力顯著高于75%、80%和85%含水量對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力（P＜0.05），極顯著高于85%含水量對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；65%、70%和 75%含水量對應(yīng)的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是極顯著高于85%含水量對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.01），其中70%含水量對應(yīng)的果膠酶活力最高，且顯著高于80%含水量對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.05）；含水量對木聚糖酶活力沒有顯著影響（P>0.05）。因此，黑曲霉發(fā)酵涼茶渣的適宜含水量是70%。

圖3 含水量對酶活力的影響Fig.3 Effects of moisture content on enzyme activity

2.1.4 發(fā)酵時間對酶活力的影響

如果發(fā)酵時間過短，發(fā)酵不完全；發(fā)酵時間過長，菌種老化，產(chǎn)生有害的次級代謝產(chǎn)物，甚至造成菌體自溶[23]。向涼茶渣培養(yǎng)基補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，溫度為31℃，含水量為80%，考察時間從48 h延長到144 h，對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，內(nèi)切葡聚糖酶活力隨著時間延長先增加后降低，其中120 h對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力最高，且顯著高于48 h對應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶活力（P＜0.05）；72 h 后果膠酶活力變化不顯著（P>0.05），但是144 h對應(yīng)的果膠酶活力顯著高于48 h對應(yīng)的果膠酶活力（P＜0.05）；96 h后木聚糖活力變化不顯著（P>0.05），但是均極顯著高于48 h和72 h對應(yīng)的木聚糖酶活力（P＜0.01）。綜合分析，黑曲霉發(fā)酵涼茶渣適宜時間是120 h。

圖4 時間對酶活力的影響Fig.4 Effects of fermentation time on enzyme activity

2.1.5 浸泡液pH值對酶活力的影響

向涼茶渣培養(yǎng)基中補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，含水量為80%，31℃發(fā)酵72 h，考察浸泡液pH值對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 浸泡液pH值對酶活力的影響Fig.5 Effects of pH of soaking solution on enzyme activity

由圖5可知，發(fā)現(xiàn)浸泡液pH值從5.00變化到8.00時，內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著變化（P>0.05），當(dāng)浸泡液pH值為9.00（培養(yǎng)基pH值實測值約7.24）時，則顯著降低（P＜0.05）。隨著pH值從5.00變化到9.00時，果膠酶活力呈現(xiàn)“V”型變化，在pH值為7.00時最低。木聚糖酶活力隨pH值變化不大，但是pH值為8.00的酶活力顯著高于pH值為7.00時的酶活力（P＜0.05）。因此，黑曲霉發(fā)酵涼茶渣的較適宜pH值為8.0。

2.1.6 溫度對酶活力的影響

向涼茶渣培養(yǎng)基中補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，含水量為 80%，發(fā)酵 72 h，考察 28、31、34、37℃以及室溫25℃對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響見圖6。

圖6可以看出，34℃內(nèi)切葡聚糖酶活力極顯著高于25℃和37℃內(nèi)切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；31℃果膠酶活力極顯著高于25、28℃和37℃果膠酶活力（P＜0.01），顯著高于 34 ℃果膠酶活力（P＜0.05），而 34℃果膠酶活力顯著高于25、28℃和37℃果膠酶活力（P＜0.05）；34℃木聚糖酶酶活力極顯著高于25℃和37℃木聚糖酶活力（P＜0.01），顯著高于28℃木聚糖酶活力（P＜0.05）。因此，34℃是黑曲霉發(fā)酵涼茶渣產(chǎn)酶的較適宜溫度。

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on enzyme activity

2.2 正交試驗

單因素試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間越長，含水量越低，酶活力越高，因此在正交試驗中將發(fā)酵時間延長至168h，含水量降低至60%，以探索更寬的時間和含水量范圍對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響。向涼茶渣培養(yǎng)基中補(bǔ)充4%硫酸銨和2%葡萄糖，對含水量（A）、浸泡液pH（B）、溫度（C）以及發(fā)酵時間（D）4個因素進(jìn)行3個水平正交試驗，結(jié)果見表2。

含水量（A）、浸泡液 pH（B）、溫度（C）以及發(fā)酵時間（D）對3種酶活力總和的極差（R）表現(xiàn)為：RD（10.28）>RC（9.21）>RB（4.74）>RA（2.65），因此，對3種酶活力總和的影響顯著性順序依次為發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、浸泡液pH值和含水量。

由表2可知，在A因素中，K2>K3>K1；在B因素中，K3>K2>K1；在C因素中，K1>K2>K3；在D因素中，K3>K2>K1。因此，各因素水平對3種酶活力總和的影響強(qiáng)弱順序是：A2>A3>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，D3>D2>D1，即，當(dāng)含水量為 70%（第2水平），浸泡液pH值為9.00（第3水平），發(fā)酵溫度為31℃（第1水平），時間為168 h（第3水平），對應(yīng)的酶活力總和最高，因此該條件組合（A2B3C1D3）是3種酶的最佳生產(chǎn)工藝。

表2 涼茶渣固態(tài)發(fā)酵正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result of herbal tea residue fermentation

2.3 驗證試驗

以硫酸銨為氮源，葡萄糖為碳源，菌種濃度為2×109CFU/mL，當(dāng)菌種接種量為10%時，經(jīng)驗證，含水量為70%，浸泡液pH值為9.00，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵168 h，即最佳工藝條件（A2B3C1D3）下，內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶活力均較高，分別為（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，3 種酶活力總和為（77.96±1.08）U/g，與正交試驗結(jié)論相符。

3 討論與結(jié)論

黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶是一個復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，菌株種類、基質(zhì)成分、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等對酶活力都有重要影響。經(jīng)過紫外誘變的黑曲霉NW1在察氏培養(yǎng)基中發(fā)酵84 h，纖維素酶活力達(dá)到1.52 U/mL[24]，比未誘變的菌株提高了1.58倍。黑曲霉CICC40616發(fā)酵含有豆粕和木聚糖的培養(yǎng)基，經(jīng)優(yōu)化后木聚糖酶活力為82.43 U/mL[25]；黑曲霉WS003發(fā)酵豆粕和麩皮混合培養(yǎng)基，果膠酶活力達(dá)到81.06 U/mL[26]。

在檢測酶活力時，不同的對照設(shè)置方法會造成酶活力有較大差異。由于物料渣或其它培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的還原糖，同時培養(yǎng)基自身含有一定的還原糖，因此，在利用3，5-二硝基水楊酸顯色法檢測發(fā)酵液的酶活力時，如果利用蒸餾水代替發(fā)酵液作為對照，必然會使發(fā)酵液中原有的大量還原糖都被計為酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，造成酶活力偏高。對于本試驗，涼茶渣發(fā)酵液中還原糖濃度是內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的葡萄糖濃度的5倍以上，也是果膠酶反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖濃度，或木聚糖酶反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖濃度的50%甚至數(shù)倍。解決這個問題的辦法就是以蒸餾水代替底物溶液作為對照，或者以滅活的酶液作為對照[26-27]，這樣僅僅引入較小的干擾。

本文以黑曲霉GIM3.562為菌種對涼茶渣進(jìn)行發(fā)酵，通過對較多單因素進(jìn)行試驗考察，為涼茶渣發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶提供比較豐富的數(shù)據(jù)支撐；通過正交試驗優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)含水量為70%，浸泡液pH值為9.00，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵168 h，是產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最佳工藝，該工藝條件下，3種酶活力均較高，分別為（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，總和為（77.96±1.08）U/g。本研究為涼茶渣的資源化利用提供了參考。