血漿保存時間和制備方法對冷沉淀凝血因子質(zhì)量的影響

單泓，李建斌，別立莉，劉敏，李曉暉，王姣杰

(河南省紅十字血液中心 成分室，河南 鄭州 450000)

新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)最好在6 h(ACD保養(yǎng)液)或者8 h(CPDA保養(yǎng)液)內(nèi)制備，2012年新的國家標(biāo)準(zhǔn)將FFP制備時間延長至18 h[1]，采血后8～18 h內(nèi)制備出的FFP，用于制備冷沉淀凝血因子(簡稱冷沉淀)效果如何，目前說法不一[2-4]。冷沉淀含有豐富的凝血因子Ⅷ(blood coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)等，在臨床被廣泛用于血友病、手術(shù)后出血等的治療。冷沉淀中的FⅧ不穩(wěn)定，易受制備過程中時間、溫度及制備方法等的影響，從而產(chǎn)生較大的質(zhì)量差異，影響臨床應(yīng)用效果。為制備出高質(zhì)量的冷沉淀，本研究選取采血后8 h內(nèi)及8～18 h制備完成的FFP，分別采用全自動冷沉淀制備儀和低溫融化箱兩種設(shè)備進(jìn)行冷沉淀的制備，探析不同制備方法對冷沉淀質(zhì)量的影響及8～18 h內(nèi)所制FFP制備冷沉淀的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器所用試劑和儀器包括FⅧ活性測定試劑盒(希森美康，批號56500325)、Fib測定試劑盒(希森美康，批號547688)、全自動血凝分析儀(希森美康，型號CA-510)、大容量低溫離心機(jī)(西格瑪)、恒溫?fù)u擺式融化箱(CT-4T.6C)、冷沉淀制備儀(沃塘)、威高速凍機(jī)、河南省紅十字血液中心智能一體化平臺(唐山啟奧科技有限公司)。

1.2 材料隨機(jī)選取2019年12月至2020年1月鄭州地區(qū)采集的400 mL全血(CPDA保養(yǎng)液)240袋，采集后冷藏保存，其中120袋于8 h內(nèi)制備成FFP(A組)，120袋于8～18 h制備成FFP(B組)，離心條件為：溫度2～6 ℃，4 100g，離心18 min。分離出每袋200 mL的血漿，速凍后保存48 h備用。

1.3 制備方法取出保存的A組和B組FFP，每組隨機(jī)選取60袋采用恒溫?fù)u擺式水浴箱制備冷沉淀，60袋用全自動冷沉淀制備儀制備冷沉淀。

1.3.1恒溫?fù)u擺式水浴箱法 從低溫冰箱中取出FFP，于室溫下放置5 min后置于融化箱中，轉(zhuǎn)移空袋置于融化箱外，啟動融化箱，使箱體充滿水，血漿袋完全浸泡于1～6 ℃水中，待血漿部分溶解后松開血漿導(dǎo)管夾，使融化的血漿通過虹吸效應(yīng)進(jìn)入空袋中。肉眼觀察，當(dāng)原血漿袋內(nèi)白色絮狀物剩余量相當(dāng)于冷沉淀所需量時，關(guān)閉血漿導(dǎo)管夾，阻斷虹吸，稱重并將容量調(diào)整至40～50 mL，熱合斷開，將獲取的冷沉淀迅速放入血漿速凍機(jī)中速凍后于-18 ℃以下保存。

1.3.2全自動冷沉淀制備儀法 從-18 ℃以下低溫冰箱中取出FFP，于室溫下放置3～5 min，將原料血漿放入全自動冷沉淀制備儀的稱重盒稱重后，將血漿袋置于1～6 ℃水浴槽融化，轉(zhuǎn)移袋留在稱重盒內(nèi)，將血袋導(dǎo)管卡入導(dǎo)管夾，水浴槽中的冰凍血漿在融化過程中通過虹吸作用，從高位的血漿袋流至低位轉(zhuǎn)移袋，當(dāng)血漿袋中剩余重量達(dá)到預(yù)設(shè)值時，導(dǎo)管夾自動夾閉血袋導(dǎo)管，并通過聲音報警及按鈕亮燈提醒制備已完成。操作人員取出冷沉淀血袋和轉(zhuǎn)移血漿袋，熱合離斷，粘貼產(chǎn)品標(biāo)簽，將冷沉淀放入全自動水平接觸式血漿速凍機(jī)中速凍后于-18 ℃以下保存。制備過程中，通過采用智能一體化平臺與冷沉淀制備儀進(jìn)行對接，對全自動冷沉淀制備儀運(yùn)行情況進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，設(shè)置關(guān)鍵項數(shù)據(jù)警戒線，可展示制備溫度、制備人員、產(chǎn)品重量、制備時間及制備流程等，出現(xiàn)異常實(shí)時報警，提醒工作人員及時干預(yù)，并實(shí)時提取Shinow 9.0中冷沉淀制備的有效數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、展示。

1.4 檢測方法將待檢測的冷沉淀凝血因子置于37 ℃恒溫水浴箱中，完全融化充分混勻后將袋內(nèi)血漿擠入至與血袋相連的導(dǎo)管內(nèi)，熱合并斷開導(dǎo)管，取導(dǎo)管中的樣品，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.5 觀察指標(biāo)FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量、Fib含量符合率。

2 結(jié)果

2.1 采血后8 h內(nèi)制備的FFP，采用制備儀與水浴箱制備的冷沉淀質(zhì)量比較以采血后8 h內(nèi)制備的FFP為原料，采用全自動冷沉淀制備儀和恒溫水浴箱制備的冷沉淀均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。制備儀組FⅧ含量符合率、Fib含量高于水浴箱組(P<0.05)，兩組FⅧ含量、Fib含量符合率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 A組制備儀與水浴箱制備的冷沉淀質(zhì)量比較

2.2 采血后8～18 h內(nèi)制備的FFP，采用制備儀與水浴箱制備的冷沉淀質(zhì)量比較對于采血后8～18 h內(nèi)制備的FFP，采用恒溫水浴箱制備的冷沉淀部分符合國家標(biāo)準(zhǔn)，采用全自動冷沉淀制備儀制備的冷沉淀全部符合國家標(biāo)準(zhǔn)。制備儀組FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量、Fib含量符合率均高于水浴箱組(P<0.05)。見表2。

表2 B組制備儀與水浴箱制備的冷沉淀質(zhì)量比較

2.3 A組與B組制備儀制備的冷沉淀質(zhì)量比較根據(jù)冷沉淀制備儀制備結(jié)果，用A組FFP制備的冷沉淀FⅧ含量、FⅧ含量符合率、Fib含量符合率高于B組(P<0.05)，兩組Fib含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 A組與B組冷沉淀制備儀制備的冷沉淀 質(zhì)量比較

3 討論

冷沉淀是由FFP在1～6 ℃的條件下融化后，分離出來的白色絮狀沉淀物，主要富含F(xiàn)Ⅷ、Fib等活性物質(zhì)，由于純度、濃度高等優(yōu)點(diǎn)，已在臨床廣泛應(yīng)用。冷沉淀的質(zhì)量關(guān)乎臨床輸注和治療效果，影響冷沉淀質(zhì)量的因素很多，如制備方法、溫度、時間、原料血漿等[5]，如何提高或保證冷沉淀的質(zhì)量，國內(nèi)外專家學(xué)者進(jìn)行了多方面的探索。采血后，F(xiàn)Ⅷ含量隨著時間推移不斷減少，在冷鏈保證的前提下，18 h內(nèi)制備的FFP，其FⅧ能達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，這是18 h內(nèi)制備的FFP用于制備冷沉淀的主要依據(jù)[6]。

為制備出高質(zhì)量的冷沉淀，近年來本研究團(tuán)隊一直致力于冷沉淀制備工藝、流程、方法方面的探索。2019年之前主要采用恒溫水浴箱制備冷沉淀，利用虹吸原理，邊融化邊虹吸已融化的血漿至轉(zhuǎn)移袋，最后剩余40～50 mL的沉淀物，即為冷沉淀。制備過程中，嚴(yán)密觀察，優(yōu)化流程，盡可能縮短制備時間，制備好的冷沉淀及時置入速凍冰箱，縮短室內(nèi)放置時間，預(yù)防不穩(wěn)定凝血因子衰減，由此有效保證冷沉淀的質(zhì)量。但是，采用恒溫水浴箱制備冷沉淀，操作人員需不斷將冷沉淀取出觀察，憑經(jīng)驗和主觀感覺判斷容量，容量過多時需重新放入繼續(xù)融化，取、放血袋的操作，易導(dǎo)致血袋晃動，使已附著在冰漿上的有效成分被虹吸入冷上清血袋。另外，水浴箱各部分溫度不均衡，制備過程中人為干擾較多，這些因素均會直接影響冷沉淀中FⅧ、Fib的含量和回收率[7-8]，而采用全自動冷沉淀制備儀可有效克服上述不足[9-10]。2019年，河南省紅十字血液中心實(shí)現(xiàn)冷沉淀制備自動化、信息化，通過全自動冷沉淀制備儀與智能一體化平臺進(jìn)行對接，實(shí)時監(jiān)控融化溫度及血漿容量，記錄和保存制備過程中的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，讓冷沉淀制備過程更加精準(zhǔn)流暢。

為得到更直觀的數(shù)據(jù)，給同行提供參考，本研究比較了全自動冷沉淀制備儀與恒溫水浴箱制備的冷沉淀的質(zhì)量。研究結(jié)果顯示：對于8 h內(nèi)制備的FFP，采用全自動冷沉淀制備儀與恒溫水浴箱制備的冷沉淀均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但全自動制備儀制備的冷沉淀質(zhì)量優(yōu)于后者；對于8～18 h內(nèi)制備的FFP，采用全自動冷沉淀制備儀制備的冷沉淀全部符合國家標(biāo)準(zhǔn)，而采用恒溫水浴箱制備的冷沉淀僅部分符合國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果表明，采用全自動制備儀制備冷沉淀效果優(yōu)于恒溫水浴箱，全自動制備儀制備冷沉淀的方式值得推薦。2012年，新的國家標(biāo)準(zhǔn)將FFP的制備時間延長到18 h，但以采血后8～18 h內(nèi)制備出的FFP為原料制備的冷沉淀質(zhì)量如何，文獻(xiàn)報道較少。本研究比較了A組與B組冷沉淀的質(zhì)量，結(jié)果前者FⅧ含量高于后者，兩組Fib含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以往的研究證實(shí)，F(xiàn)Ⅷ是一種不穩(wěn)定因子，其活性會隨著時間延長而顯著降低，F(xiàn)ib雖比較穩(wěn)定，但亦有文獻(xiàn)報道其含量隨著分離時間的延長呈下降趨勢[11-12]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，為保證冷沉淀質(zhì)量，采血后應(yīng)盡可能在8 h內(nèi)制備出FFP，且采用全自動冷沉淀制備儀制備的冷沉淀質(zhì)量更佳。