MFC監(jiān)測(cè)MRD在AML形態(tài)學(xué)緩解患者中的應(yīng)用價(jià)值

王 楠，馮硯平，陳 康，傅 強(qiáng)，王偉佳

廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一種惡性、異質(zhì)性、克隆性疾病，具有高度基因復(fù)雜性。通過(guò)聯(lián)合化療誘導(dǎo)緩解后，80%的AML患者可以達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解(mCR)，但是超過(guò)50%的成年患者會(huì)復(fù)發(fā)，這與化療后微小殘留病灶(MRD)的增殖有關(guān)。所以，尋找采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無(wú)法觀察到的MRD，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療策略，改善疾病預(yù)后，延長(zhǎng)患者生存期具有重要意義。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MFC)通過(guò)使用熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體組來(lái)評(píng)估造血細(xì)胞的抗原表達(dá)，識(shí)別白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)，可廣泛應(yīng)用于90%的AML患者，且檢測(cè)速度快，靈敏度高[1]。本研究對(duì)138例經(jīng)誘導(dǎo)化療后達(dá)到mCR的AML患者進(jìn)行了相關(guān)分析，應(yīng)用MFC監(jiān)測(cè)患者骨髓標(biāo)本的MRD,分析其在AML復(fù)發(fā)與預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2019年5月本院收治的經(jīng)過(guò)1～2個(gè)療程誘導(dǎo)化療后達(dá)到mCR的AML患者(排除M3型)138例。所有患者均進(jìn)行骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫表型、分子生物學(xué)檢查，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)和FAB標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診和分型,參照2019年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)AML相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行危險(xiǎn)分層[2]。

1.2方法

1.2.1治療方案及療效判斷 白細(xì)胞水平過(guò)高的患者首先使用羥基脲或聯(lián)合白細(xì)胞單采清除術(shù)降低白細(xì)胞水平。根據(jù)患者的年齡及各方面情況，采用IA、HAA、MA、TA、CAG及DCAG等方案進(jìn)行誘導(dǎo)化療。根據(jù)治療效果及遺傳學(xué)危險(xiǎn)分層，預(yù)后良好的患者鞏固化療6～8個(gè)療程，預(yù)后不良的患者在完全緩解后進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植，若無(wú)移植條件，則采用聯(lián)合化療。參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行療效判斷，分為完全緩解、部分緩解、無(wú)效。

1.2.2MFC檢測(cè)MRD 根據(jù)初診時(shí)每個(gè)患者的免疫分型結(jié)果確定相應(yīng)的LAIP，以此作為MRD檢測(cè)的標(biāo)志。于每次化療后3周左右或下次化療前抽取患者骨髓，采用MFC進(jìn)行MRD檢測(cè)(流式細(xì)胞儀由美國(guó)Becton-Dickinson公司生產(chǎn))。以CD45/SCC設(shè)門(mén)，獲取10 000～20 000個(gè)細(xì)胞，所使用的單克隆抗體包括cMPO、CD13、CD33、CD117、CD34、CD38、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD19、CD20、cCD22、cCD79a、CD2、CD3、CD4、CD8、CD7、CD10等，設(shè)定具有LAIP的細(xì)胞>0.1%為MRD陽(yáng)性[3]。

1.3隨訪 采用查閱患者門(mén)診、住院病歷及電話(huà)聯(lián)系等方式進(jìn)行隨訪，隨訪日期截止2020年3月31日?？偵嫫诙x為患者從確診至死亡或隨訪截止的時(shí)間，無(wú)復(fù)發(fā)生存期定義為患者從mCR至復(fù)發(fā)或隨訪截止的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床特征 138例患者中，MRD陽(yáng)性31例，占22.5%。MRD陽(yáng)性與MRD陰性患者性別、年齡、初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、初診時(shí)血紅蛋白(HB)、初診時(shí)血小板計(jì)數(shù)(PLT)、初診時(shí)乳酸脫氫酶(LDH)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在化療第1療程達(dá)到mCR的患者中，MRD陰性有89例(83.2%)，MRD陽(yáng)性有16例(51.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MRD陽(yáng)性與MRD陰性患者的臨床特征比較

組別n初診時(shí)PLT[M(P25,P75),×109/L]初診時(shí)LDH[M(P25,P75),U/L]是否在化療第1療程達(dá)到mCR[n(%)]是否MRD陽(yáng)性3135(10,62)444(275,589)16(51.6)15(48.4)MRD陰性10743(23,69)392(285,659)89(83.2)18(16.8)t/χ2/Z1.4220.60213.162P0.1550.547<0.001

2.2MRD陽(yáng)性與陰性患者的療效及生存分析 經(jīng)過(guò)2～3個(gè)療程化療后，所有患者均達(dá)到mCR。中位隨訪時(shí)間為26個(gè)月，MRD陽(yáng)性患者累計(jì)復(fù)發(fā)率為61.3% ，高于MRD陰性患者的48.6%(χ2=4.407，P=0.036)；MRD陽(yáng)性患者總生存率為54.8%，低于MRD陰性患者的70.1%(χ2=4.332，P=0.037)；MRD陽(yáng)性患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率為38.7%，低于MRD陰性患者的49.5%(χ2=4.408，P=0.035)。Kaplan-Meier生存曲線見(jiàn)圖1。

注：A為累計(jì)復(fù)發(fā)率；B為總生存率；C為無(wú)復(fù)發(fā)生存率。

2.3MRD陽(yáng)性患者接受不同治療方案后的生存情況 31例MRD陽(yáng)性患者在誘導(dǎo)緩解后有19例繼續(xù)采用鞏固化療，12例接受異基因造血干細(xì)胞移植。鞏固化療患者總生存率為47.4%，低于異基因造血干細(xì)胞移植患者的66.7%(χ2=4.190，P=0.041)。Kaplan-Meier生存曲線見(jiàn)圖2。

圖2 鞏固化療患者與異基因造血干細(xì)胞移植患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

AML是一種具有高度異質(zhì)性、進(jìn)展快的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，隨著醫(yī)療水平的快速提高及大量新藥的研發(fā)應(yīng)用，AML患者的完全緩解率明顯提高，生存期延長(zhǎng)。但仍有半數(shù)以上的患者會(huì)在緩解后一段時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致生存期縮短，最終死亡，其主要原因是在達(dá)到mCR后骨髓中的MRD持續(xù)存在且出現(xiàn)增殖，導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)。所以，MRD監(jiān)測(cè)在指導(dǎo)個(gè)性化治療、更早發(fā)現(xiàn)藥物耐藥性、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，以及評(píng)價(jià)治療效果等方面均具有重要意義[4]。目前，臨床常用的定量檢測(cè)MRD的方法包括MFC檢測(cè)LAIP和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)特異性融合基因。RT-qPCR的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和特異度高，但是通常用于檢測(cè)特定遺傳學(xué)及分子學(xué)異常的患者所存在的融合基因及基因突變[5]，如PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH1等融合基因及NPM1、FLT3等基因突變等，而存在這些遺傳學(xué)及分子學(xué)異常的患者僅占所有AML患者的60%～70%[6]，因此該方法存在一定的局限性。MFC可以識(shí)別每個(gè)患者獨(dú)特的LAIP，并將其作為該患者的MRD在后續(xù)樣本檢測(cè)中進(jìn)行追蹤，可廣泛應(yīng)用于90%的AML患者，且采用MFC檢測(cè)MRD的靈敏度較高。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究肯定了MRD在AML mCR患者中的預(yù)后意義[7-10]。FREEMAN等[7]使用MFC評(píng)估2 450例成年AML患者M(jìn)RD的研究指出，首次誘導(dǎo)化療后MRD陽(yáng)性患者與化療后部分緩解患者的生存結(jié)局類(lèi)似，特別是在中風(fēng)險(xiǎn)及高風(fēng)險(xiǎn)患者中；對(duì)于NPM1野生型中風(fēng)險(xiǎn)患者，兩個(gè)療程化療誘導(dǎo)后，MRD陽(yáng)性與不良預(yù)后顯著相關(guān)。張瑩等[8]對(duì)131例AML患者的研究顯示，在獲得mCR后接受鞏固化療的患者中，MRD陽(yáng)性患者的5年總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯低于MRD陰性患者。本研究結(jié)果顯示，MRD陽(yáng)性患者累計(jì)復(fù)發(fā)率高于MRD陰性患者，總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于MRD陰性患者，與上述報(bào)道相似。

目前，對(duì)AML患者治療前進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層主要根據(jù)年齡、遺傳學(xué)及分子學(xué)等，MRD對(duì)預(yù)后的重要意義提示可將其作為治療后危險(xiǎn)分層的參考依據(jù)，可根據(jù)AML治療后MRD的狀態(tài)來(lái)進(jìn)行危險(xiǎn)分層，并指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療。以MRD為依據(jù)的危險(xiǎn)分層相關(guān)研究大多數(shù)是針對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的，ZUGMAIER等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，在3次強(qiáng)化治療后完全緩解但MRD陽(yáng)性的前體B-ALL患者中，經(jīng)過(guò)靶向CD19+的博納吐單抗治療后，與MRD轉(zhuǎn)陰的患者相比，MRD未轉(zhuǎn)陰患者的總生存率、無(wú)復(fù)發(fā)生存率更低，緩解期更短。目前，在AML中以MRD為基礎(chǔ)指導(dǎo)危險(xiǎn)分層治療的研究較少，1項(xiàng)國(guó)外的前瞻性臨床試驗(yàn)將AML患者細(xì)胞遺傳學(xué)和MFC聯(lián)合用于評(píng)估鞏固化療后MRD的情況，用來(lái)指導(dǎo)患者的緩解后治療，結(jié)果顯示，在鞏固化療后MRD陽(yáng)性的中風(fēng)險(xiǎn)患者中，異基因造血干細(xì)胞移植可以延長(zhǎng)總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期，使其與MRD陰性患者的生存結(jié)局接近[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MRD陽(yáng)性患者中，鞏固化療患者總生存率低于異基因造血干細(xì)胞移植患者，說(shuō)明異基因造血干細(xì)胞移植可以改善MRD陽(yáng)性患者的預(yù)后，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。

綜上所述，mCR后MRD陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)率高，采用MFC監(jiān)測(cè)AML患者mCR后的MRD對(duì)患者預(yù)后具有重要意義，可以早期發(fā)現(xiàn)易復(fù)發(fā)患者，為個(gè)性化地制訂緩解后治療方案提供依據(jù)。但目前以MRD為依據(jù)指導(dǎo)臨床干預(yù)措施這一觀點(diǎn)仍需要大量的前瞻性研究來(lái)證明。