56 ℃ 30 min熱滅活新型冠狀病毒對輸血相容性檢測結(jié)果的影響

郭 黠，蒯迪文

湖南省岳陽市二人民醫(yī)院輸血科，湖南岳陽 414000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm，其基因特征與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有明顯區(qū)別[1]。SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，但氯己定不能有效滅活病毒[1]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)潛伏期1～14 d，多為3～7 d;傳染源主要是COVID-19患者，無癥狀感染者也可能成為傳染源;主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫傳播和密切接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠的情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能,人群普遍易感[1]。SARS-CoV-2具有很強的傳染性和致病性，對確診或疑似為COVID-19的患者標本進行輸血相容性檢測時，必須在具有生物安全柜和二級安全防護的條件下進行。但受條件限制，很多基層醫(yī)院實驗室尚未達到相關(guān)防護標準，當送檢標本中存在未診斷或無癥狀的COVID-19患者標本時，因缺乏防護措施，很有可能造成SARS-CoV-2在實驗室中的傳播。因此，在進行輸血相容性檢測前首先對醫(yī)院送檢的所有患者的血液標本進行SARS-CoV-2滅活處理，再對滅活后的標本進行常規(guī)輸血相容性檢測，可突破普通實驗室條件的限制，消除實驗室工作人員在檢測中的感染風險。本研究通過對標本加熱56 ℃ 30 min，模擬滅活SARS-CoV-2的條件，分析滅活前后紅細胞血型抗原強度、抗體效價的變化，探討SARS-CoV-2熱滅活處理對輸血相容性檢測的影響，為今后在普通實驗室條件下通過熱滅活病毒開展輸血相容性檢測提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 標本1：從普通住院患者血液標本中選取20份A型血、20份B型血和20份O型血標本進行血型檢測。標本2：從獻血者留樣血辮中隨機選取3份A型血(編號1～3)、3份B型血(編號4～6)標本，以及從住院患者血液標本中選擇1份經(jīng)鑒定含IgM型抗-M的標本(患者1)進行IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測。標本3：從獻血者留樣血辮中隨機選取3份O型血(編號7～9)標本，以及從住院患者血液標本中選擇1份經(jīng)鑒定含IgG型抗-E的標本(患者2)進行IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測。

1.2儀器與試劑 FYQ免疫微柱孵育器、TD-3A型血型血清學用離心機(長春博研科學儀器有限責任公司)，KA-2200血清學專用離心機(日本久保田公司)，56 ℃恒溫水浴箱。ABO、RhD血型定型檢測卡(單克隆抗體)、抗人球蛋白微柱凝膠卡(長春博迅生物技術(shù)有限公司)。單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司，批號：20191000705)，單克隆RhD(IgM)血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司，批號：20191001105)，二巰基乙醇(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20187702)，抗體鑒定譜細胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20191205)。A、B型標準紅細胞由本科室新鮮自配。檢測抗-A、抗-B效價使用的紅細胞為本科室自配的A、B型新鮮紅細胞，試管法凝集強度≥++++；檢測抗-M效價使用的是抗體鑒定譜細胞中M抗原為純合子的2號細胞和5號細胞混合液；檢測抗-E效價使用的是抗體鑒定譜細胞中E抗原為純合子的1號細胞和6號細胞混合液。

1.3方法

1.3.1紅細胞ABO、RhD血型抗原檢測 將標本1中所有標本均分裝為2管，1管分別用試管法、微柱凝集法鑒定其血型，記錄其凝集強度并計算積分；另1管進行56 ℃ 30 min熱滅活處理，待冷卻離心后分別用試管法、微柱凝集法鑒定其血型，記錄其凝集強度并計算積分,判讀標準見表1。

表1 ABO、RhD血型鑒定凝集強度積分

1.3.2IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測 將標本2中所有標本均分裝為2管，1管進行56 ℃ 30 min熱滅活處理，離心，然后取50 μL用生理鹽水按1∶32的比例稀釋，加入對應(yīng)的3%標準A型、B型或O型紅細胞懸液50 μL，混勻。另1管取出50 μL后不進行熱滅活，直接用生理鹽水按1∶32的比例進行稀釋，然后加入對應(yīng)的3%標準A型、B型或O型紅細胞懸液50 μL，混勻，1 000×g離心15 s，觀察并記錄試管法凝集強度。

1.3.3IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測 將標本3中所有標本均分裝為2管，1管進行56 ℃ 30 min熱滅活處理，離心,然后取100 μL按1∶1的比例加入等量的二巰基乙醇，37 ℃溫育15 min破壞IgM抗體，離心,然后取出50 μL用生理鹽水按1∶32的比例稀釋，每管加入對應(yīng)的3%標準A型、B型或O型紅細胞懸液50 μL，混勻。另1管不進行熱滅活，離心后取100 μL按1∶1的比例加入等量的二巰基乙醇，37 ℃溫育15 min破壞IgM抗體后取出50 μL，用生理鹽水按1∶32的比例進行稀釋，然后加入對應(yīng)的3%標準A型、B型或O型紅細胞懸液50 μL，混勻。最后分別加入抗人球蛋白微柱凝膠卡，孵育離心后觀察并記錄凝集強度。

2 結(jié) 果

2.1紅細胞ABO、RhD血型抗原檢測結(jié)果 56 ℃ 30 min熱滅活后，試管法ABO、RhD血型鑒定凝集強度積分與未進行熱滅活相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；56 ℃ 30 min熱滅活后，微柱凝集法ABO、RhD血型鑒定凝集強度積分與未進行熱滅活相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ABO、RhD血型鑒定凝集強度積分分)

血型n56 ℃ 30 min熱滅活試管法抗-A抗-B抗-D微柱凝集法抗-A抗-B抗-DAcBcO型20--5.45±1.10*--10.60±0.9410.00±0.929.80±0.62A型2010.00±0.92*-5.30±1.22*12.00±0.00-10.60±1.14-9.30±0.98B型20-10.10±0.79*5.50±1.32*-11.90±0.4510.50±0.899.50±0.89-

2.2IgM型抗-A、抗-B和抗-M及IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測結(jié)果 56 ℃ 30 min熱滅活與未進行熱滅活的IgM型抗-A、抗-B、抗-M效價和IgG型抗-A、抗-B效價檢測結(jié)果完全相同；56 ℃ 30 min熱滅活后IgG型抗-E效價的檢測結(jié)果在允許范圍之內(nèi)。見表3、4。

表3 IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測結(jié)果

表4 IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測結(jié)果

3 討 論

COVID-19是一種急性呼吸道傳染性疾病，具有很強的傳染性，目前已納入乙類傳染病，并要求按甲類傳染病管理[1]。輸血科工作人員在輸血相容性檢測過程中，直接或間接與各類標本接觸，其中就有可能接觸到COVID-19患者的標本，由于條件限制，極易因職業(yè)暴露而增加工作人員的感染風險。在檢測前先進行病毒滅活處理，可消除檢測人員的職業(yè)暴露風險。SARS-CoV-2對熱敏感，56 ℃ 30 min可有效滅活病毒，該滅活方法適用于基層醫(yī)療單位[2]，本研究基于此探討了56 ℃ 30 min熱滅活SARS-CoV-2 對輸血相容性檢測結(jié)果的影響。

輸血相容性檢測一般包括血型鑒定和交叉配血，因此，紅細胞血型抗原強度的變化和血型抗體效價的變化對輸血相容性檢測至關(guān)重要。除了ABO血型抗-A、抗-B外，本研究還選擇了1種IgM型和1種IgG型的不規(guī)則抗體作為代表來檢測效價的變化。抗-M是最常見的IgM型抗體，抗-E是最常見的IgG型抗體[3-5]，所以，本研究選擇這兩種抗體作為不規(guī)則抗體檢測的代表。研究表明，熱滅活處理可能會減弱紅細胞表面血型抗原的強度，影響試管法血型鑒定的凝集強度，特別是對RhD血型的影響尤其明顯[6]。從本研究結(jié)果來看，經(jīng)56 ℃ 30 min熱滅活處理后，試管法鑒定血型時凝集強度減弱，但并不影響對血型鑒定的最終判定；而使用微柱凝集法鑒定血型時，其凝集強度與未進行熱滅活處理時的凝集強度無明顯差異。分析其原因：(1)紅細胞的A、B抗原為糖類抗原，RhD抗原為蛋白多肽類抗原，在56 ℃熱滅活過程中，隨著時間的延長，其與相應(yīng)抗體的反應(yīng)性有一個逐漸降低的過程，但不至于降到很低；(2)56 ℃熱滅活處理時，隨著孵育時間的延長溶血逐漸加重[6]，但溶血并不會降低血型抗原的抗原性；(3)本研究在熱滅活過程中使用的是全血，血漿對紅細胞可能有一定的保護作用，因此，56 ℃ 30 min熱滅活處理對血型鑒定結(jié)果的影響微乎其微。同時，本研究結(jié)果還顯示，56 ℃ 30 min熱滅活處理不會降低血清中抗-A、抗-B、抗-E、抗-M的效價，能保證在輸血前檢測中不會遺漏掉重要的抗體，能一定程度上保障輸血安全性。值得一提的是，在56 ℃ 30 min熱滅活處理后，需要重新離心標本再進行相關(guān)檢測，以排除變性蛋白對檢測結(jié)果的影響。

綜上所述，通過56 ℃ 30 min熱滅活處理臨床標本來預(yù)防SARS-CoV-2的傳播，是一種行之有效的方法，對輸血相容性檢測的影響幾乎可以忽略不計，在一些條件受到限制，防護措施不完善的基層醫(yī)院可推廣使用，可有效保護一線檢驗工作人員的人身安全。