新型冠狀病毒核酸提取方法的性能評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用

吳永彬，萬(wàn) 穎，蔣紅玲，張 晶，辛 杰

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西桂林 541002

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種具有包膜結(jié)構(gòu)的正鏈單股RNA病毒，不僅可感染人類，還能感染其他哺乳類動(dòng)物和鳥(niǎo)類，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等病變[1]。目前，實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SARS-CoV-2核酸是篩查和診斷新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的重要手段[2]，通過(guò)對(duì)SARS-CoV-2序列中的開(kāi)放閱讀框(ORF)1ab 、核衣殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因的特異性保守序列設(shè)計(jì)靶區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)標(biāo)本核酸檢測(cè)。然而，該方法自臨床應(yīng)用以來(lái)仍缺乏可靠的質(zhì)量控制，已開(kāi)展SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室或機(jī)構(gòu)大多采用自建體系進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有形成統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。就試劑而言，各廠家推薦的標(biāo)本前處理方法及核酸提取方法并不統(tǒng)一，試劑之間的差異可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不一致。當(dāng)某項(xiàng)定量檢測(cè)項(xiàng)目在正式用于標(biāo)本檢測(cè)前或檢測(cè)系統(tǒng)有重大改變后，必須對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能做出詳細(xì)、充分的評(píng)價(jià)，確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)符合臨床要求[3]。本研究評(píng)價(jià)了3種不同的SARS-CoV-2核酸提取方法用于核酸定量檢測(cè)時(shí)的分析性能及臨床應(yīng)用價(jià)值，以期為COVID-19的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性的COVID-19確診病例17例，其中男8例，女9例；年齡24～79歲，中位年齡42歲；病程4～24 d；危重型4例，普通型13例。所有患者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)標(biāo)本于2020年2月12—19日在本院感染性疾病病區(qū)收集，其中深咳痰液標(biāo)本13份，大便標(biāo)本4份。COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[4]。本研究經(jīng)本院倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)(批準(zhǔn)文號(hào)2020NXSYYEC-003)。

1.2儀器與試劑 電熱恒溫水浴箱(型號(hào)：HH.W21.600S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，漩渦混合器(型號(hào)：XH-B，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)，全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)(型號(hào)：Natch CS,湖南圣湘生物科技有限公司)，熒光定量PCR擴(kuò)增系統(tǒng)(型號(hào)：SLAN-96P，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)。樣本釋放劑(批號(hào)：S1014，湖南圣湘生物科技有限公司，裂解法)，核酸提取及純化試劑(批號(hào)：SDK60102，江蘇碩世科技股份有限公司，柱提法)，核酸提取或純化試劑(批號(hào)：S1002，湖南圣湘生物科技有限公司，磁珠法)，核酸擴(kuò)增試劑(批號(hào)：2020088，湖南圣湘生物科技有限公司，熒光PCR法)。

1.3方法

1.3.1SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 所有標(biāo)本在檢測(cè)前先進(jìn)行56 ℃、30 min滅活，并混勻5～10 s后待檢。使用3種SARS-CoV-2核酸提取方法(裂解法、柱提法、磁珠法)，按操作說(shuō)明書(shū)提取核酸，最后均提取20 μL SARS-CoV-2核酸液作為擴(kuò)增模板。在熒光定量PCR擴(kuò)增系統(tǒng)上選擇FAM(ORF1ab)和ROX(N) 通道檢測(cè)SARS-CoV-2核酸，選擇HEX通道檢測(cè)內(nèi)標(biāo)。設(shè)置50 ℃、熱循環(huán)30 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；在95 ℃下反應(yīng)1 min使cDNA預(yù)變性；然后按照95 ℃、15 s，60 ℃、30 s循環(huán)45次。最后根據(jù)擴(kuò)增信號(hào)得出Ct值，并根據(jù)核酸擴(kuò)增試劑說(shuō)明書(shū)判定檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2性能驗(yàn)證

1.3.2.3最低檢測(cè)限驗(yàn)證 選取低水平且雙靶標(biāo)(ORF1ab、N)Ct值接近的弱陽(yáng)性標(biāo)本8份，用陰性對(duì)照標(biāo)本依次按1∶1的比例稀釋為8個(gè)水平接近試劑盒定量檢測(cè)下限的標(biāo)本，分別用3種方法提取SARS-CoV-2核酸并檢測(cè)，每份標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)4次，連續(xù)檢測(cè)10 d。參考EP7-A2[7]，計(jì)算陽(yáng)性檢出率及最低檢測(cè)限。

1.3.2.4臨床應(yīng)用評(píng)估 取17份COVID-19確診病例標(biāo)本，分別采用3種方法同時(shí)提取并檢測(cè)SARS-CoV-2核酸，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算3種核酸提取方法下檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率、靶標(biāo)檢出率，分析3種核酸提取方法兩兩之間檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗(yàn)證結(jié)果 3種核酸提取方法下高、中、低水平標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的CVr和CVi均小于目標(biāo)CV(5%)，符合廠家聲明的精密度標(biāo)準(zhǔn)，可滿足臨床需求。見(jiàn)表1。

表1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.2正確度驗(yàn)證結(jié)果 3種核酸提取方法下檢測(cè)3個(gè)水平標(biāo)本的偏倚均小于允許偏倚，可接受，其中采用裂解法提取核酸時(shí)的偏倚較柱提法和磁珠法大，采用磁珠法提取核酸時(shí)3個(gè)水平標(biāo)本的檢測(cè)偏倚均最小。見(jiàn)表2。

表2 正確度驗(yàn)證結(jié)果

2.3最低檢測(cè)限驗(yàn)證結(jié)果 3種核酸提取方法下8個(gè)水平標(biāo)本的檢出率見(jiàn)表3。Probit回歸分析結(jié)果顯示，模型擬合度均可接受，采用裂解法、柱提法、磁珠法提取核酸時(shí)的最低檢測(cè)限(Ct值)分別是37.42、37.87、39.61，均符合廠家聲明的最低檢測(cè)限。

表3 3種核酸提取方法下的檢出率比較[n(%)]

2.4方法學(xué)比較 在17份COVID-19確診病例標(biāo)本中，有15份標(biāo)本在3種核酸提取方法下均檢測(cè)為陽(yáng)性，其中裂解法和柱提法、磁珠法和柱提法的陽(yáng)性符合率均為94.11%，裂解法和磁珠法的陽(yáng)性符合率為88.23%。3種核酸提取方法下的檢測(cè)結(jié)果兩兩之間均呈良好的線性關(guān)系(P<0.05)，其中，采用柱提法和磁珠法提取核酸時(shí)的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性最好(r=0.905，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

注：A為柱提法與裂解法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析；B為磁珠法與裂解法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析；C為柱提法與磁珠法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析。

2.53種核酸提取方法下的靶標(biāo)檢出率比較 17例COVID-19確診病例標(biāo)本中，采用裂解法提取核酸時(shí)檢出15例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為88.2%，柱提法提取核酸時(shí)檢出16例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為94.1%，磁珠法提取核酸時(shí)檢出17例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100.0%。進(jìn)一步分析靶標(biāo)檢出率，雙靶標(biāo)(ORF1ab+/N+)檢出率最高的是磁珠法，為64.7%(11/17)，其次是柱提法的52.9%(9/17)和裂解法的41.2%(7/17)；單靶標(biāo)中，ORF1ab-/N+在3種核酸提取方法中的檢出率相當(dāng)，而ORF1ab+/N-的檢出率均較低。3種核酸提取方法下的靶標(biāo)(ORF1ab+/N-、ORF1ab-/N+、ORF1ab+/N+)檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：a為ORF1ab+/N-；b為ORF1ab-/N+；c為ORF1ab+/N+；d為ORF1ab-/N-。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常使用自建檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)SARS-CoV-2[8]，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)系統(tǒng)，我國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》和《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》均要求需對(duì)檢驗(yàn)程序的性能進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)其能滿足預(yù)期用途后方可用于臨床檢測(cè)。但國(guó)內(nèi)目前對(duì)SARS-CoV-2自建檢測(cè)系統(tǒng)性能驗(yàn)證的具體方法尚未達(dá)成廣泛共識(shí)，本研究對(duì)3種核酸提取方法下自建檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、正確度、最低檢測(cè)限等指標(biāo)進(jìn)行了性能分析，并將其用于臨床評(píng)價(jià)。

為使檢測(cè)結(jié)果具有可比性，本研究采取了除核酸提取過(guò)程不同外，其余操作均相同的檢測(cè)方案，整體來(lái)看，3種核酸提取方法下自建檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)SARS-CoV-2的精密度、正確度均通過(guò)驗(yàn)證，但采用磁珠法提取核酸時(shí)的檢測(cè)偏倚、CVr和CVi普遍比裂解法與柱提法小(除磁珠法低水平標(biāo)本的CVi和中水平標(biāo)本的CVr略大于柱提法外)，表明與人工操作相比，自動(dòng)化操作可減少操作誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。此外，采用磁珠法提取核酸時(shí)的最低檢測(cè)限(Ct值)稍優(yōu)于裂解法與柱提法，檢測(cè)靈敏度更高，這有利于低水平病毒RNA的檢出?？紤]出現(xiàn)上述差異與試劑提取原理有關(guān)，裂解法是一種通過(guò)簡(jiǎn)化的蛋白變性劑和生化試劑混合來(lái)抽提核酸的方法，操作簡(jiǎn)單，標(biāo)本量?jī)H需10 μL，適合病毒載量高、雜質(zhì)少的標(biāo)本，但如果標(biāo)本不滿足上述要求則易漏檢，產(chǎn)生“假陰性”結(jié)果。柱提法是采用特殊玻璃纖維濾膜高效吸附核酸片段來(lái)提取核酸，操作環(huán)節(jié)較多，易造成核酸丟失，但其最終獲得的核酸純度較高。磁珠法是以磁珠為載體進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸提取的方法，在保證核酸提取純度的同時(shí)，也保證了模板純度。

本研究以17例COVID-19確診病例標(biāo)本為臨床研究對(duì)象，比較了3種核酸提取方法下檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率及結(jié)果間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，3種核酸提取方法下檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率較高，且結(jié)果間兩兩均呈線性相關(guān)。本研究還比較了3種核酸提取方法下靶標(biāo)的檢出情況，結(jié)果顯示，3種核酸提取方法下的靶標(biāo)(ORF1ab+/N-、ORF1ab-/N+、ORF1ab+/N+)檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明這3種核酸提取方法均可用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。但值得注意的是，本研究納入的臨床樣本量較少，患者的標(biāo)本類型、發(fā)病時(shí)間、病情嚴(yán)重程度、用藥情況等因素也不一致，因此結(jié)果有待后續(xù)的大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究評(píng)價(jià)的這3種核酸提取方法均可滿足臨床SARS-CoV-2的檢測(cè)需求，且磁珠法相較裂解法與柱提法具有更好的性能。