紅外光譜法用于安鈉咖中咖啡因和苯甲酸鈉快速定性和定量分析

蘇承軻，劉翠梅，孟鑫，花鎮(zhèn)東，段凱

1.鄂爾多斯市公安局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017000；2.公安部禁毒情報技術中心 毒品監(jiān)測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，北京100193

現(xiàn)有的安鈉咖中咖啡因的定性方法主要為顯色法[1]和氣相色譜-質(zhì)譜法，定量分析方法主要為滴定法[1]和高效液相色譜法[4]。定性方法中顯色法準確度低，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測速度慢、成本高。定量方法中滴定法操作繁瑣，高效液相色譜法操作繁瑣、檢測速度慢、成本高?；谒p全反射（attenuated total reflectance，ATR）的紅外光譜法基本無需樣品前處理，測試速度快、檢測成本低、綠色環(huán)保，已被用于毒品、易制毒化學品、新精神活性物質(zhì)的快速定性和定量檢測[5-8]。本研究在分析大量繳獲安鈉咖樣品紅外光譜圖的基礎上，挑選咖啡因和苯甲酸鈉的特征吸收峰，建立采用紅外光譜法定性分析安鈉咖中咖啡因和苯甲酸鈉的方法；同時，采用混合制樣的方法制備定量建模樣本，建立采用紅外光譜和偏最小二乘法（partial least squares，PLS）定量分析安鈉咖中咖啡因和苯甲酸鈉的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

FrontierTMFT-IR/NIR 光譜儀配備金剛石光窗的單次衰減全反射附件（美國PerkinElmer 公司），LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm；美國Agilent 公司）。Scientz-15DZ 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司），HW450AS 型遠紅外干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司），XS 105 電子天平（美國梅特勒-托利多公司），KQ 3200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Lab Dancer渦旋振蕩器（德國IKA公司）。直徑3mm金屬球用于研磨使用。

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merk公司）、三乙胺（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）、濃磷酸（含量≥85%，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。咖啡因［阿拉丁試劑（上海）有限公司，純度99%］，苯甲酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，純度99%）。48 份繳獲安鈉咖樣品由鄂爾多斯市公安局提供。

1.2 樣品制備

將繳獲的安鈉咖樣品于70 ℃烘箱干燥2 h，記錄烘干前和烘干后質(zhì)量。取適量樣品和1個金屬球裝入5 mL 的塑料離心管中，采用高通量組織研磨器對其進行研磨混勻，研磨功率為70 Hz，研磨時間為2 min。

將高純度咖啡因和苯甲酸鈉按不同質(zhì)量比例混合，配制成咖啡因純度（質(zhì)量分數(shù)）分別為7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、95%的17 個樣品。配制樣品的質(zhì)量約為0.2 g。將稱量好的樣品和一個金屬球裝入5 mL 的塑料離心管中，采用高通量組織研磨器對其進行研磨混勻，研磨功率為70 Hz，研磨時間為2 min。

1.3 傅里葉變換紅外光譜

取研磨均勻的固體樣品適量，均勻地鋪展在ATR窗口的上表面，壓緊使緊密接觸，波數(shù)范圍4 000 cm-1～550 cm-1，分辨率4 cm-1，采樣次數(shù)16 次。采集時間小于1 min。

紅外光譜圖的采集和定量建模分析采用Spectrum 10.5.3和Spectrum Quant軟件10.5.3（美國PerkinElmer公司）。

果蔬運輸系統(tǒng)作為服務行業(yè)，應用物聯(lián)網(wǎng)技術對提升整體管理水平，使果蔬運輸服務在速度上和質(zhì)量上得以體現(xiàn)，使得運輸過程中數(shù)據(jù)的傳輸更加準確及時，便于交互、監(jiān)控并及時反饋信息。

采用SPSS 17.0.1 軟件（美國IBM 公司）進行配對樣本t檢驗分析。

1.4 PLS定量模型

采用全波段光譜進行計算，選取標準正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）校正聯(lián)合一階導數(shù)的光譜預處理方法，建立PLS 定量分析模型，計算模型的決定系數(shù)（R2）、交叉驗證均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV）、預測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）。

計算測試樣品與所建PLS 定量模型的馬氏距離值，馬氏距離值小于3 時表明測試樣品與建模樣品的基質(zhì)極為相似，定量結果可靠[9]。

選取一個咖啡因和苯甲酸鈉混合樣品（咖啡因純度為35%）進行PLS 定量模型的重復性和重現(xiàn)性考察。將該樣品在1 d 內(nèi)連續(xù)測定6 次，計算6 次測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），作為重復性數(shù)據(jù)；將6 份樣品分別在不同的6 d 中進行測定，計算6 次測定結果的RSD，作為重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。

1.5 高效液相色譜分析

Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，檢測波長240 nm，流動相A 相為乙腈，流動相B相為磷酸-三乙胺緩沖液（濃磷酸4.12 mL 被200 mL 超純水稀釋，取三乙胺5.56 mL 滴入磷酸溶液中，再加入水稀釋至1 000 mL，混勻后超聲脫氣備用）。梯度洗脫：0 min 15%A，0～5.0 min 15%～80%A，5.0～5.2 min 80%～90%A，5.2～7.0 min 90%A，7.0～7.2 min 90%～15%A，7.2～10.0 min 15%A。咖啡因的保留時間為3.02 min，苯甲酸鈉的保留時間為4.64 min。

準確稱取安鈉咖樣品5.00 mg 于15 mL 塑料離心管中，加入10 mL 甲醇，放入超聲波清洗器中超聲10 min，輔助溶解，以5 000×g離心10 min，取1 mL 進LC-20A 高效液相色譜儀分析。

準確稱取咖啡因和苯甲酸鈉標準品5.00 mg 于10 mL 玻璃容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，超聲10 min 溶解，配制成0.5 mg/mL 的標準樣品溶液，取1 mL 進LC-20A 高效液相色譜儀分析。

1.6 傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜定量方法的比較

選取咖啡因純度在25%～50%的9 個實際繳獲安鈉咖樣品，分別采用高效液相色譜和傅里葉變換紅外光譜進行定量分析，對兩組數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜結果

咖啡因的傅里葉變換紅外光譜圖（圖1A）中1 693、1 644 cm-1為C=O 雙鍵的伸縮振動，1 547 cm-1為C=N 雙鍵的伸縮振動，1 481、1 454 cm-1為N-CH3的反對稱變角振動，1 429、1 404 cm-1為N-CH3的對稱變角振動，1 358、743 cm-1為環(huán)狀酰亞胺結構的伸縮振動，1 285～1 024 cm-1為C-N 鍵的伸縮振動。

苯甲酸鈉的傅里葉變換紅外光譜圖（圖1B）中1 596 cm-1為苯環(huán)的伸縮振動，1 548、1 406 cm-1為C=O的伸縮振動，706 cm-1為苯環(huán)的彎曲振動。

圖1C 為咖啡因與苯甲酸鈉混合樣品（咖啡因純度50%）的傅里葉變換紅外光譜圖，圖中咖啡因和苯甲酸鈉的紅外吸收峰明顯可見?；旌蠘悠分锌Х纫虻? 693 cm-1和1 644 cm-12 個吸收峰的位置發(fā)生了較大的偏差，變?yōu)? 698 cm-1和1 650 cm-1，這是因為純咖啡因樣品中這2 個峰為寬峰，而混合樣品中變?yōu)檎?，峰形發(fā)生了變化，所以峰的位移也發(fā)生了較大變化。

圖1D 是咖啡因和苯甲酸鈉混合物（咖啡因純度10%～80%）的紅外光譜圖?？Х纫虻?個吸收峰1 698、1 650、1 237、972、743、609 cm-1和苯甲酸鈉的6 個吸收峰1 596、1 548、1 406、845、708、679 cm-1在所有的混合物樣品中均檢出，因此將上述峰分別定為咖啡因和苯甲酸鈉的特征吸收峰。

圖1E 是48 份安鈉咖繳獲樣品（未經(jīng)干燥處理）的傅里葉變換紅外光譜圖。分析結果表明，所有樣品中均檢出了咖啡因（1 698±8）、（1 650±8）、（1 237±3）、（972±4）、（743±3）、（609±3）cm-16 個吸收峰和苯甲酸鈉（1596±3）、（1548±3）、（1406±3）、（845±3）、（708±3）、（679±3）cm-16 個吸收峰。

多數(shù)繳獲安鈉咖樣品性狀潮濕，從圖1E 中也可以看出，超過三分之二的安鈉咖繳獲樣品在900～600 cm-1出現(xiàn)基線下移，這是典型的含水樣品的特點（圖1F）。但這些潮濕樣品的基線下滑并不影響其特征峰的檢出。

圖1 ATR-傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 ATR-Fourier transform infrared spectra

2.2 特征吸收峰法的定性檢出限

圖2 為咖啡因純度分別為7.5%和10%的2 個混合樣的紅外光譜圖，當咖啡因的純度為7.5%時，檢出了咖啡因的5 個特征吸收峰和苯甲酸鈉的6 個特征吸收峰，咖啡因的1 650 cm-1峰未檢出。當咖啡因的純度為10%時，咖啡因和苯甲酸鈉的6 個特征吸收峰均檢出。在苯甲酸鈉純度為5%的混合樣品中檢出了苯甲酸鈉的6 個特征吸收峰。因此，采用特征吸收峰為定性判別依據(jù)時，安鈉咖中咖啡因和苯甲酸鈉定性分析的檢出限分別為10%和5%。

圖2 咖啡因與苯甲酸鈉混合物的ATR-傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 ATR-Fourier transform infrared spectra for mixture of caffeine and sodium benzoate

2.3 PLS定量分析模型的建立

采用全波段光譜進行計算，選取SNV 聯(lián)合一階導數(shù)的光譜預處理方法，建立PLS 定量分析模型。所得到的標準曲線見圖3?？Х纫騊LS 定量模型的線性范圍為10%～80%，R2為99.9%、RMSECV 為0.68%，RMSEP 為0.91%；苯甲酸鈉PLS 模型的線性范圍為20%～90%，R2為99.9%、RMSECV 為0.91%、RMSEP 為1.11%。

為了保證定量結果的準確性，定量建模樣品和實際樣品的性狀不能有太大的差異。由于配制的定量建模樣品是干燥的，而多數(shù)繳獲樣品性狀潮濕，所以，實際繳獲樣品在采集光譜前需要先進行烘干處理。烘干時記錄烘干前后質(zhì)量的變化。

經(jīng)測定，PLS 定量分析方法中咖啡因的重復性為0.39%、重現(xiàn)性為1.28%，苯甲酸鈉的重復性為0.67%、重現(xiàn)性為2.40%，可見所建定量模型的測定精度高。

圖3 PLS定量模型標準曲線Fig. 3 PLS quantitative model standard curve

2.4 傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜定量方法的比較結果

選取咖啡因純度在25%～50%的9 個實際繳獲樣品，分別采用高效液相色譜和傅里葉變換紅外光譜進行定量分析，結果見表1。對2 組數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗，傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜測定的咖啡因純度平均值分別為39.6%和38.1%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜測定的苯甲酸鈉純度平均值分別為60.4%和63.0%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，傅里葉變換紅外光譜的測定結果準確可靠。

表1 安鈉咖樣品中咖啡因和苯甲酸鈉傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜測定純度結果比較Tab. 1 Comparison of the determined purity of caffeine and sodium benzoate in Annaca samples by Fourier transform infrared spectrum and high performance liquid chromatography （%）

2.5 安鈉咖繳獲樣品測定

采集48 份繳獲樣品的傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)，采用特征吸收峰法對樣品進行定性分析，所有樣品均檢出了咖啡因和苯甲酸鈉。為了保證待測樣品與建模樣品的基質(zhì)一致，在進行定量分析前需要對樣品進行干燥處理，干燥后樣品與建模樣品中咖啡因之間的馬氏距離值0.03～1.30，干燥后樣品與建模樣品中苯甲酸鈉之間的馬氏距離值0.02～1.20。干燥后樣品計算得到的馬氏距離值均小于3，說明測試樣品與建模樣品的基質(zhì)極為相似，因此計算所得定量結果可靠。48 份干燥樣品中咖啡因的純度為27.6%～63.1%，平均值為41%；苯甲酸鈉的純度為36.9%～72.3%，平均值為59.0%。需要說明的是，某些實際繳獲樣品中可能會摻入其他物質(zhì)，導致計算得到的馬氏距離值大于3，此時采用高效液相色譜定量方法進行定量分析結果會更加準確。

2.6 結論

本研究建立了安鈉咖樣品中咖啡因和苯甲酸鈉快速定性和定量分析的傅里葉變換紅外光譜方法，確定了咖啡因和苯甲酸鈉的6 個特征吸收峰，以全部特征吸收峰均檢出為陽性判斷依據(jù)時，咖啡因的定性檢出限為10%。建立了基于紅外光譜的PLS 定量模型，模型線性好，檢測精度高。采用配對樣本t檢驗法對高效液相色譜和傅里葉變換紅外光譜的測定結果進行了比較，結果表明，兩個方法的定量結果之間差異無統(tǒng)計學意義。采用所建立的傅里葉變換紅外光譜定量方法分析了48 份安鈉咖繳獲樣品，樣品中咖啡因的純度為27.6%～63.1%、苯甲酸鈉的純度為36.9%～72.3%。