白毛藤多糖對(duì)人卵巢癌A2780/DDP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張杰，楊驕霞，翟鳳國(guó)，周福波，林峰，李厚忠，楊旭東＊

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

順鉑(cisplatin，DDP)作用強(qiáng)、抗腫瘤譜廣泛，對(duì)卵巢癌療效顯著，是化療中常用的藥物。其作用機(jī)制主要是誘發(fā)DNA 單鏈內(nèi)或雙鏈間相鄰鳥(niǎo)嘌呤產(chǎn)生交聯(lián)進(jìn)而破壞DNA，抑制細(xì)胞DNA 自我復(fù)制[1-2]，但長(zhǎng)期使用順鉑往往產(chǎn)生耐藥性，限制其在臨床化療的應(yīng)用。白毛藤（Solamum lyratum Thunb）屬于茄科植物，具有消腫、解毒等作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，白毛藤的不同組分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制等作用[3-4]，本研究旨在進(jìn)一步觀察白毛藤多 糖（Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP）在逆轉(zhuǎn)A2780/DDP 人卵巢癌順鉑耐藥中的作用及其分子機(jī)制，為SLTP 應(yīng)用于卵巢癌的輔助化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

A2780/DDP 人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、RPMI-1640 培養(yǎng)液和RNA 提取試劑(Trizol) (美國(guó)Sigma公司)，胰酶（美國(guó)Gibco 公司），DDP（德州德藥制藥有限公司），RT-PCR 試劑盒及引物（大連寶生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)分為4 組，空白對(duì)照組（含A2780/DDP 細(xì)胞的RPMI-1640 培養(yǎng)液）、順鉑組（2μg/mLDDP）、順鉑+低劑量SLTP 組（2μg/mLDDP+0.4mg/mLSLTP）、順 鉑+高劑量SLTP 組（2μg/mLDDP+1.6mg/mLSLTP）。

1.2.2 測(cè)定藥物敏感性的MTT 實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780/DDP 細(xì)胞，以5×103個(gè)/mL細(xì)胞密度，接種至96 孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL。按照細(xì)胞分組，分別加入不同濃度DDP 和SLTP，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。分別孵育12，24 和48h 時(shí)各加入5g/LMTT20μL 溶液；繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去全部上清液，每孔加100μLDMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm 的各孔OD 值。細(xì)胞抑制率（inhibition rate，IR）=（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）×100%。

1.2.3 Hoechst33258 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照Hoechst33258 熒光染料試劑說(shuō)明書檢測(cè)A2780/DDP 細(xì)胞凋亡情況。固定：固定液4℃，10 min；漂洗：0.01mol/L PBS 漂洗3 次，5min/次；染色：Hoechst33258 染色液（5mg/L）染色15min；封片：封片劑（甘油與PBS 比例為1:9）封片。顯微鏡下觀察到的藍(lán)色深染、細(xì)胞核碎裂的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率={凋亡細(xì)胞/（凋亡細(xì)胞+正常細(xì)胞）}×100%。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)

設(shè)計(jì)引物如下：PTEN上游：5'-ATACCAGGACCAGAGGAAACCC-3'；下游：5'-TTGTCATTATCCGACGCTC-3'，擴(kuò)增片段為101 bp。Survivin 引物，上游：5'-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3'；下游：5'-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3'，擴(kuò)增片段329bp。GAPDH上游引物：5'-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3'，下游：5'-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3'，擴(kuò)增片段288bp。條件：95℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃復(fù)性60s，72℃延伸55s，40 個(gè)循環(huán)，72℃復(fù)性5min。凝膠成像系統(tǒng)拍照，軟件分析PTEN、SurvivinmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組A2780/DDP 細(xì)胞藥物敏感性情況

順鉑+低劑量SLTP 組和順鉑+高劑量SLTP 組能明顯提高對(duì)A2780/DDP 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，與順鉑組比較具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（）

表1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（）

注：與順鉑組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況

不同濃度SLTP 聯(lián)合順鉑作用于A2780/DDP 細(xì)胞后，各組細(xì)胞的凋亡率各不相同，與空白對(duì)照組凋亡率（2.98%）比較，順鉑組凋亡率（14.94%）顯著升高（P＜0.01）。與順鉑組比較，順鉑+低劑量SLTP 組（17.17%）和順鉑+高劑量SLTP 組（23.61%）凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），見(jiàn)圖1、2、3、4。

圖1 空白對(duì)照組（400×）

圖2 順鉑組（400×）

圖3 順鉑+低劑量SLTP（400×）

圖4 順鉑+高劑量SLTP 組（400×）

2.3 各組細(xì)胞PTEN、Survivin 基因表達(dá)情況

與順鉑組比較，不同劑量SLTP 聯(lián)合順鉑作用于A2780/DDP 細(xì)胞48h 后，A2780/DDP 細(xì)胞中凋亡抑制因子Survivin 表達(dá)降低（P＜0.01，P＜0.05），促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加化療敏感的PTEN表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05），順鉑+高劑量SLTP 組最顯著（P＜0.01），見(jiàn)表2、圖5、6。

表2 各組A2780/DDP 細(xì)胞PTEN 和Survivin 基因表達(dá)（）

表2 各組A2780/DDP 細(xì)胞PTEN 和Survivin 基因表達(dá)（）

注：與空白對(duì)照組比較,** P＜0.01，* P＜0.05；與順鉑組比較,##P＜0.01，# P＜0.05。

圖5 各組細(xì)胞survivin 基因表達(dá)

圖6 各組細(xì)胞PTEN 基因表達(dá)

3 討論

目前我國(guó)婦科的惡性腫瘤中死亡率最高的是卵巢癌[5-6]，順鉑是術(shù)后恢復(fù)的患者聯(lián)合化療的基礎(chǔ)[7]?；煹年P(guān)鍵是提高順鉑的敏感性，降低耐藥性，同時(shí)降低順鉑毒副作用。細(xì)胞凋亡抑制是腫瘤發(fā)生機(jī)制之一，抗凋亡基因及凋亡基因在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因此成為了卵巢癌治療中的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。PTEN 基因定位于10 號(hào)染色體短臂（10q23.3），是一個(gè)雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，可調(diào)控細(xì)胞周期，也可參與細(xì)胞間粘附[8-9]，作用于在多種腫瘤中可增加多種化療藥物的敏感性[10]。本研究證實(shí)，高低劑量的SLTP 分別與順鉑合用可明顯上調(diào)A2780/DDP 細(xì)胞中PTEN 基因表達(dá)，隨著藥物劑量的增加，A2780/DDP 細(xì)胞中PTEN 基因表達(dá)逐步上調(diào)，與順鉑組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族，不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)[11-12]。本研究證實(shí)，高低劑量的SLTP 分別與順鉑合用可明顯下調(diào)A2780/DDP 細(xì)胞中Survivin 基因表達(dá)，隨著劑量的增加，細(xì)胞中Survivin 基因表達(dá)顯著下調(diào)，與順鉑組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，SLTP 可通過(guò)調(diào)控Survivin 及PTEN基因的表達(dá)，從而輔助順鉑誘導(dǎo)A2780/DDP 細(xì)胞的凋亡并抑制A2780/DDP 細(xì)胞增殖，增加順鉑的藥效。為SLTP 進(jìn)一步應(yīng)用于卵巢癌順鉑耐藥的輔助治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體協(xié)同作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。