自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷中自噬的研究進(jìn)展*

米 楊，譚 贏，張繼勤 綜述，尹 浩△ 審校

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，貴陽(yáng) 550002；3.貴州省人民醫(yī)院麻醉科，貴陽(yáng) 550002)

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是腦血管破裂出血并滲到蛛網(wǎng)膜下腔的神經(jīng)系統(tǒng)急癥，其中動(dòng)脈瘤性SAH(aSAH)占50%～80%[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SAH后腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，經(jīng)過治療的SAH患者中，30%～70%會(huì)發(fā)生CVS導(dǎo)致腦缺血[3]。雖然應(yīng)用內(nèi)皮素-1(ET-1)受體拮抗劑可以降低CVS發(fā)生率，但病死率和預(yù)后沒有顯著變化[4]。這表明SAH后CVS并不是影響患者預(yù)后的唯一因素。有學(xué)者認(rèn)為，在SAH早期階段腦組織更容易受損，表明早期腦損傷(early brain injury，EBI)可能是導(dǎo)致患者致殘甚至死亡的另一重要原因，包括神經(jīng)炎癥和微血管功能障礙等損傷[5]。SAH后腦損傷分為EBI和延遲性腦缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)。EBI指SAH最初72 h內(nèi)發(fā)生的病理生理變化，而DCI指3～14 d內(nèi)的缺血性損傷[6-7]，EBI包括短暫腦缺血、血腦屏障損壞、血管痙攣、代謝衰竭、炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生等[8-9]，都會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成損傷[10]，而自噬可以在EBI發(fā)揮重要作用，包括維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[11]、降低細(xì)胞凋亡水平[12]、減輕腦水腫等，合理應(yīng)用自噬可能為治療SAH帶來(lái)新的方向。

1 自噬與EBI相關(guān)信號(hào)通路

自噬一詞源于希臘語(yǔ)中的“自我”和“進(jìn)食”，意為細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，提供新的物質(zhì)用于維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[13]。在實(shí)驗(yàn)性SAH模型中，自噬可以對(duì)EBI包括腦水腫、血腦屏障損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等損傷進(jìn)行改善[14]。研究表明，自噬可能由多種信號(hào)傳導(dǎo)通路共同調(diào)控，這些通路錯(cuò)綜復(fù)雜，在哺乳動(dòng)物中，已發(fā)現(xiàn)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、活性氧(ROS)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、Beclin-1、Ras/蛋白激酶A(PKA)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信號(hào)傳導(dǎo)通路均可能介導(dǎo)自噬的發(fā)生，而mTOR、ROS作為多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因素。

1.1 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號(hào)通路

自噬的特點(diǎn)是形成稱為自噬體的雙膜小泡，將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)降解，為細(xì)胞在能量缺乏狀態(tài)下提供新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]。AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能量狀態(tài)的主要感受器，其通過感知一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)和二磷酸腺苷(ADP)/ATP比值從正、反兩個(gè)方面調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量狀態(tài)[16]，一方面促進(jìn)生成ATP的分解代謝過程，另一方面抑制消耗ATP的合成代謝過程[17-18]。其中，細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)翻譯是細(xì)胞ATP消耗的主要原因，mTOR作為自噬多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，AMPK抑制蛋白質(zhì)合成的能力是通過直接抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在結(jié)節(jié)硬化綜合征(TSC)細(xì)胞中，AMPK磷酸化TSC2并激活TSC，從而衰減 mTORC1途徑。此外，AMPK通過磷酸化Ser15來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白p53，mTORC1的活化增強(qiáng)p53的翻譯，兩種效應(yīng)共同作用致使p53在葡萄糖缺乏的TSC細(xì)胞中聚集，促使細(xì)胞凋亡。研究證明，自噬激活劑雷帕霉素對(duì)TSC缺陷細(xì)胞中mTORC1的抑制可以維持細(xì)胞內(nèi)ATP水平，并在能量缺乏時(shí)抑制AMPK的激活，完整AMPK-TSC信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于抑制mTORC1通路在能量壓力條件下調(diào)控細(xì)胞存活和生長(zhǎng)是必要的[19]。在EGAN等[20]的研究中，同樣揭示了能量感應(yīng)和自噬核心蛋白自噬激活激酶1(ULK1)之間的聯(lián)系，研究表明當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，AMPK可以磷酸化ULK1并使其發(fā)揮功能，從而觸發(fā)自噬級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)，而mTORC1通過抑制ULK1的磷酸化而抑制自噬的啟動(dòng)?？梢夾MPK既通過直接激活磷酸化ULK1激活自噬，同時(shí)抑制mTORC1的活性，解除mTORC1對(duì)ULK1的抑制，從正、反向同時(shí)促進(jìn)自噬的激活。此外，在細(xì)胞中還存在一種自噬體形成的關(guān)鍵膜標(biāo)記蛋白Vps34，哺乳動(dòng)物的Vps34存在于不同的復(fù)合物中，通過 AMPK的差異調(diào)節(jié)，可以調(diào)節(jié)自噬的起始，這是因?yàn)锳MPK可以通過ATG14L逆轉(zhuǎn)AMPK對(duì)Vps34-Beclin-1復(fù)合物活性的抑制作用，經(jīng)AMPK直接磷酸化Beclin-1，進(jìn)而激活自噬前體Vps34復(fù)合物，促使自噬形成[6，21]。而自噬經(jīng)由AMPK通路激活后緩解EBI的神經(jīng)細(xì)胞損傷作用已在LI等[22]的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。

1.2 PI3K/Akt信號(hào)通路

細(xì)胞中酪氨酸激酶可以在生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激下被激活，經(jīng)過一系列過程最終激活PI3K，PI3K可以將4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，而10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)可負(fù)性調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路致使PI3K的D3位去磷酸化生成PIP2。生成的PIP3使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，然后血小板-白細(xì)胞C激酶與PIP3共同導(dǎo)致Akt構(gòu)象改變，同時(shí)使Thr308和Ser743磷酸化，這些使Akt激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡并通過抑制半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)活性阻止凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[23]。另外，mTOR作為Akt的下游分子，結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚體復(fù)合物抑制mTOR的功能，但是活化的Akt可以抑制TSC-1/TSC-2復(fù)合物的形成，而解除其對(duì)mTOR的抑制功能，使mTOR激活；Akt也可以直接作用mTORC1使mTOR激活。激活的mTOR調(diào)控核糖體S6蛋白激酶(S6K)、真核生物啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)，對(duì)特定的mRNA翻譯及蛋白質(zhì)合成進(jìn)行調(diào)控[24]。YU等[25]研究表明，P13K/Akt通路激活在減輕SAH誘導(dǎo)的腦損傷方面具有重要作用；而SUN等[26]研究中對(duì)大鼠SAH模型給予κ阿片受體激動(dòng)劑Salvinorin A，在EBI期可改善神經(jīng)元凋亡，同時(shí)Bax和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達(dá)下調(diào)，表明自噬可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路參與EBI。

1.3 ROS信號(hào)通路

SAH作為一種神經(jīng)系統(tǒng)急癥，其發(fā)生時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列可以氧化蛋白質(zhì)、脂類及核酸等物質(zhì)的ROS分子，這些ROS分子在SAH的EBI階段可發(fā)揮激活自噬的作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界損傷刺激時(shí)，約90%的ROS由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈產(chǎn)生超氧自由基形成，隨著細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS并逐漸累積增多，為維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，激活缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)并產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物質(zhì)腺病毒E1B19000相互作用蛋白3(BNIP3)和類腺病毒E1B19kD蛋白相互作用蛋白3同源物(NIX)，它們的翻譯蛋白與線粒體膜上的Beclin-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bcl-2，從而釋放自噬的重要分子Beclin-1并介導(dǎo)自噬激活。在氧化應(yīng)激或缺氧狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受器被激活，其下游可促進(jìn)自噬基因LC3和ATG5表達(dá)并激活自噬。除上述途徑外，氧化應(yīng)激還可以激活FOXO3和NRF2，F(xiàn)OXO3刺激LC3和BNIP的表達(dá)，NRF介導(dǎo)p62的轉(zhuǎn)錄，p62轉(zhuǎn)錄的同時(shí)促進(jìn)NRF2的轉(zhuǎn)錄。所有的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)都能正向調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。抑癌基因p53可以轉(zhuǎn)錄激活許多自噬相關(guān)基因。在這些基因中，調(diào)控DNA損傷的自噬分子(DRAM)和Sestrins基因?qū)ψ允善鹫蚣せ钭饔茫@些基因與ROS之間的關(guān)系并不明確。在p53激活的基因中，TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子(TPGAR)作為一種p53靶點(diǎn)的蛋白，負(fù)向調(diào)節(jié)自噬，表明其作用與p53無(wú)關(guān)。同時(shí)，ROS抑制ATG4蛋白酶的活動(dòng)進(jìn)而促進(jìn)自噬小體的形成[27]。而在CHEN等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬可以由褪黑素激活進(jìn)而減輕EBI，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。由此可見，EBI可以釋放一系列ROS對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷，同時(shí)也可以通過自噬的激活保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡。

2 自噬參與SAH的EBI階段

研究表明，SAH后的EBI階段，Beclin-1及其他相關(guān)指標(biāo)表達(dá)顯著升高，在電鏡下可發(fā)現(xiàn)多膜胞質(zhì)空泡、核收縮、線粒體腫脹和自噬小泡等，表明受損神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體途徑激活[29-30]。此外，EBI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，鈣離子濃度升高通過1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3R)激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMKK)/AMPK通路，解除mTOR對(duì)ULK1復(fù)合物的抑制作用，單獨(dú)使用鈣離子動(dòng)員劑使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高仍可促進(jìn)自噬激活[29-30]。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SAH后溶酶體完整性被破壞，致使細(xì)胞內(nèi)損壞的線粒體聚集，同時(shí)激活自噬。

2.1 自噬與EBI的氧化應(yīng)激

SAH伴隨而來(lái)的氧化應(yīng)激可產(chǎn)生ROS，對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸都有毀滅性損傷；此外，存在于蛛網(wǎng)膜下腔的血液降解為高鐵血紅蛋白、血紅素等物質(zhì)，參與EBI[31-33]，這些ROS物質(zhì)隨著腦脊液的流動(dòng)而遍布整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[34]，同時(shí)激活自噬進(jìn)而減輕EBI帶來(lái)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[28]。FUMOTO等[35]研究顯示，在SAH模型中應(yīng)用依達(dá)拉奉后可以阻止基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)和激活，并減少血腦屏障的主要構(gòu)成因素緊密連接蛋白的降解，這在應(yīng)用其他抗氧化劑的實(shí)驗(yàn)中亦得到了驗(yàn)證[36]。除緊密連接以外，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是構(gòu)成血腦屏障的重要成分，F(xiàn)UMOTO等[35]同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平下降并可維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，這種預(yù)防作用間接表明氧化應(yīng)激可以介導(dǎo)EBI內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

2.2 自噬與EBI的神經(jīng)炎癥

LC3是自噬體的生物標(biāo)記物，Beclin-1是一種在自噬中有重要作用的Bcl-2相互作用蛋白。LC3和Beclin-1被普遍認(rèn)為是自噬的標(biāo)記物，在自噬體形成過程中表達(dá)增加，同時(shí)刺激一種細(xì)胞溶酶體降解酶組織蛋白酶D(cathepsin D)的表達(dá)。LEE等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在SAH后24 h內(nèi)，LC3-Ⅱ、Beclin-1和cathepsin D水平逐漸上升；WANG等[14]同樣證實(shí)了自噬的激活，并表明自噬在24 h達(dá)到峰值，在48 h逐漸恢復(fù)正常水平，緩解了EBI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。在神經(jīng)炎癥方面，促炎性晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)在EBI中具有調(diào)節(jié)自噬和凋亡的作用，抑制RAGE可顯著增加SAH后caspase-3和bax的裂解水平，并降低Bcl-2水平。阻斷RAGE可減少SAH引起的LC3-Ⅱ和Beclin-1上調(diào)，并減少神經(jīng)炎性細(xì)胞因子，表明RAGE在神經(jīng)炎癥方面同樣有調(diào)節(jié)作用，NF-κB借助RAGE途徑刺激神經(jīng)炎性介質(zhì)發(fā)揮主導(dǎo)作用[37]。在SAH后24 h抑制RAGE可以阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的釋放，而RAGE被阻斷時(shí)，caspase-3和bax水平升高，LC3和Beclin-1水平降低，表明抑制RAGE將促進(jìn)細(xì)胞的凋亡并抑制自噬特異因子的表達(dá)[38]。RAGE對(duì)于SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡與自噬之間的平衡反饋，可為改善SAH預(yù)后提供潛在的靶點(diǎn)。

2.3 自噬的激活與抑制

在實(shí)驗(yàn)性SAH模型中，應(yīng)用雷帕霉素(一種自噬激活劑)的小鼠早期LC3和Beclin-1水平顯著升高，24 h達(dá)高峰，其臨床行為量表上的改善優(yōu)于對(duì)照組SAH大鼠；而應(yīng)用3-甲基腺嘌呤(一種自噬抑制劑)的小鼠與前者正好相反，其神經(jīng)功能缺損加重，表明自噬的激活對(duì)EBI有一定的修復(fù)作用[14]。在改良SAH模型中，也發(fā)現(xiàn)使用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素治療會(huì)降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，增加神經(jīng)元凋亡，而雷帕霉素和預(yù)防性辛伐他汀聯(lián)合應(yīng)用可提高自噬活性，抑制細(xì)胞凋亡[39]。在這個(gè)過程中，自噬激活可以抑制線粒體凋亡途徑，減少了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而有效地改善EBI[40]。自噬的另一種激活劑褪黑素同樣可以降低caspase-3的活性和凋亡活性，包括提高LC3-Ⅱ/LC3-I比值，表明褪黑素激活自噬可改善SAH后大鼠細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而支持了自噬對(duì)EBI的保護(hù)作用[28]。

3 小 結(jié)

本文重點(diǎn)闡述了自噬在SAH后EBI階段發(fā)揮的重要作用，自噬激活可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡進(jìn)而減輕SAH造成的腦損傷，而調(diào)控自噬的主要信號(hào)通路是AMPK/mTOR信號(hào)通路，自噬激活劑可能通過磷酸化ULK1蛋白觸發(fā)自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，為SAH患者預(yù)后提供了新方向。適當(dāng)?shù)淖允杉せ羁梢詾镾AH患者帶來(lái)有益的方面，而長(zhǎng)期自噬狀態(tài)的持續(xù)和過度的自噬均會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，給神經(jīng)功能帶來(lái)一定的損傷。為此，需要更深入的研究自噬在EBI的作用機(jī)制，通過RAGE這樣潛在的靶點(diǎn)調(diào)控凋亡與自噬之間的平衡，使SAH后自噬朝著有利的方向發(fā)展。自噬參與SAH神經(jīng)保護(hù)像一把雙刃劍，必須在激活自噬的同時(shí)并對(duì)自噬進(jìn)行控制，使其在整個(gè)疾病的過程中發(fā)揮有益的作用而避免對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，故選擇適合的激活劑與自噬的調(diào)控靶點(diǎn)是下一步研究方向。因此，需要更深入地研究SAH和自噬調(diào)控的具體機(jī)制，并探究二者之間的具體關(guān)系，為SAH治療提供新的策略。