RNA m6A修飾在肺部疾病中的研究進展*

張哲明， 吳 艷， 卞 濤

（南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院呼吸與危重癥科，江蘇無錫 214000）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是指RNA 中腺苷的第6 位氮原子處發(fā)生的甲基化修飾。在已發(fā)現(xiàn)的RNA 修飾中，m6A 修飾被認為是真核生物mRNA 中最常見的修飾類型。此外，這種甲基化修飾也可發(fā)生在rRNA、tRNA、miRNA、circRNA和lncRNA［1］。Dominissini 等［2］的研究顯示，m6A 修飾位點主要集中在終止密碼子附近和長內部外顯子上，這些位點存在共有序列RRm6ACH（R=G/A，H=C/U/A），并且在人類和鼠之間高度保守。由于RNA 修飾增加了RNA 結構的復雜性，影響生物學過程［3］，因此了解m6A 修飾的功能和機制對于理解這種修飾在分子調控中的意義至關重要。m6A 修飾涉及翻譯、剪接、RNA 降解、RNA 穩(wěn)定性、miRNA 成熟等多種生物學過程［4］。m6A修飾通過甲基轉移酶（writers）和去甲基化酶（erasers）的共同作用實現(xiàn)動態(tài)可逆調節(jié)，并且可以被m6A 結合蛋白（readers）選擇性地識別結合，從而發(fā)揮作用。目前，對于m6A 修飾與肺部疾病的研究還很少，其中作用仍不清楚。本文總結有關m6A修飾的研究進展，并對m6A修飾與肺部疾病的關系進行了闡述，為深入了解肺部疾病中與m6A 修飾相關的分子標志物和治療靶點提供參考資料。

1 m6A修飾概述

writers、erasers 和readers 共同組成m6A 修飾的調控網絡，其中writers 負責催化形成m6A 修飾，erasers負責去除m6A 修飾，而readers 通過特異性識別m6A修飾的靶RNA，參與人類疾病的發(fā)生發(fā)展［5］。

1.1 m6A writers METTL3（methyltransferase-like 3）是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A 甲基轉移酶。Bokar 等［6］從HeLa 細胞中將METTL3 分離出來，觀察到它具有S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）結合活性。METTL3 通過與SAM 結合而獲得甲基轉移酶活性，在METTL3/METTL14 異二聚體和其他甲基轉移酶組成的多組分甲基轉移酶復合物中起著核心酶的作用。METTL14 作為支持酶，主要維持復合物完整性和與底物RNA 結合，增強催化活性。METTL14 C末端的RGG 重復序列是RNA 底物的結合位點，對于METTL3/14 的催化活性必不可少［7］。WTAP（Wilms′tumor 1-associated protein）是一種剪接調節(jié)因子，不具有催化域，對RNA 沒有獨立的催化能力，它通過與METTL3/14 相互作用，將后者定位到核散斑（nuclear speckles），從而激活甲基轉移酶催化活性［8］。此外，RBM15、KIAA1429 等調控酶通過與mRNA 結合并募集METTL3/14 復合體，將其引導至靶區(qū)相互作用，但具體作用機制仍不十分清楚。目前，我們所知的甲基轉移酶復合物中各組分的分子量相加與從HeLa 細胞中分離得到的復合物分子量并不相等，前者小于后者［9］。這表明甲基轉移酶復合物中存在未知writer參與調控，需要進一步探究。

1.2 m6A erasers 去甲基化酶FTO（fat mass- and obesity-associated protein/ALKB homolog 9，ALKBH9）和ALKBH5 的發(fā)現(xiàn)揭示了m6A 修飾是動態(tài)可逆的，兩者屬于ALKB 相關蛋白家族。FTO 和ALKBH5 都是非血紅素Fe2+/α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）依賴的加氧酶，而Fe2+/α-KG 這一保守結構對于去甲基化修飾是必不可少的［10］。Su等［10］對FTO功能的進一步研究顯示，F(xiàn)TO 在細胞核中催化m6A 的去甲基化，而在胞質中可同時介導m6A 和N6，2′-O-dimethyladenosine（m6Am）的去甲基化，但改變FTO 的表達水平對m6Am 修飾的RNA 的表達無明顯影響，這說明FTO 主要在細胞核中介導m6A 修飾的RNA 的表達而發(fā)揮作用。ALKBH5 定位在細胞核，在低氧條件下表達上調。目前發(fā)現(xiàn)ALKBH5 在動物中表現(xiàn)出對m6A產生有效的去甲基化活性，這可能與ALKBH5的N 末端富含丙氨酸的序列和潛在的卷曲結構有關［11］。目前為止，還沒有檢測到主要定位于細胞質的m6A 去甲基化酶，對于胞質中RNA 的m6A 修飾如何調控仍未可知，值得進一步研究。

1.3 m6A readers readers 包括含YTH（YT521-B homology）結構域蛋白家族、核內不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）超家族、胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs）、真核生物翻譯起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）等，是m6A 修飾發(fā)揮作用的基礎。

YTH 結構域是在人類剪接因子YT521-B 中被發(fā)現(xiàn)的，它在真核生物表達的100 多種蛋白中普遍存在。含YTH結構域蛋白家族分為YTHDF（YTHDF1～3）和YTHDC（YTHDC1～2）兩個亞家族［12］。YTHDF1是一個重要的m6A 結合蛋白，其依賴eIF3 啟動和增強翻譯，促進m6A 修飾的mRNA 在5′-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的非帽依賴性翻譯。相反，YTHDF2 將識別的mRNA 轉運到細胞質促進其降解。具體機制為YTHDF2 通過N 末端區(qū)域與CNOT1（CCR4-NOT transcription complex subunit 1）的SH 結構域直接相互作用，募集CCR4-NOT 復合體，從而促進染色質組裝因子1（chromatin assembly factor 1，CAF1）和CCR4（carbon catabolite repressor 4）的去甲基化作用。YTHDF3 在YTHDF1 促進mRNA 翻譯和YTHDF2 促降解中都起著協(xié)同作用，從而影響RNA的代謝［4，13］。YTHDC1 定位于細胞核，通過募集剪接因子SRSF3（serine and arginine rich splicing factor 3）和抑制SRSF10 與mRNA 結合，來調節(jié)核mRNA 的選擇性剪接。YTHDC2可以選擇性地與m6A殘基結合，降低mRNA的m6A豐度，提高其翻譯效率［14］。readers對mRNA 的翻譯既有促進也有抑制作用，這表明readers 特異性識別m6A 修飾的RNA 位點，但其在翻譯中的作用需要進一步研究。

已發(fā)現(xiàn)的與m6A 修飾有關的hnRNPs 超家族蛋白有HNRNPA2B1、HNRNPC 和HNRNPG，這些蛋白并不直接識別并結合m6A修飾位點，而是識別因m6A修飾而改變的RNA 結構，從而參與靶RNA 的加工、表達等過程。這種機制被稱為m6A 開關（m6Aswitch）［15］。HNRNPA2B1 是一種細胞核中的m6A 結合蛋白，它與核轉錄本結合，調控RNA 剪接，并促進初級miRNA 的加工［15］。此外，IGF2BPs（IGF2BP1～3）是一種相對保守的m6A 結合蛋白，幾乎只在細胞質中表達，能增強mRNA 的穩(wěn)定性，提高翻譯效率。目前已在多種侵襲性癌細胞中發(fā)現(xiàn)了IGF2BPs 的異常調節(jié)［16］?？傊琺6A 結合蛋白幾乎參與了RNA 代謝的每個環(huán)節(jié)，有很大研究價值。

2 m6A與肺部疾病

越來越多的研究表明，m6A 修飾與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）、肺癌、肺纖維化等。

2.1 m6A 修飾與COPD COPD 是一種常見的以持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發(fā)展。雖然吸煙、炎癥機制、氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等都與其密切相關，但確切的發(fā)病機制仍不清楚［17］。

研究表明，在不影響細胞活力的前提下，暴露于不同濃度的香煙煙霧等有害物質刺激后，人肺泡上皮細胞中m6A 修飾水平均顯著下降，但線性回歸分析結果未提示有劑量效應關系［18］。通過數據集進一步分析細顆粒物對m6A 修飾調控因子表達的影響，研究者觀察到高暴露組METTL3、WTAP、FTO、ALKBH5 和HNRNPC 的表達均高于低暴露組，而METTL14 和KIAA1429 的表達在兩組之間無明顯差異［18］。但是，近期Huang 等［19］用小氣道上皮細胞為樣本的研究顯示，與對照組相比，COPD 組中FTO、METTL3、ZNF217、YTHDC1 和YTHDC2 表 達 下 調，IGF2BP3 表達上調。這可能意味著m6A 修飾的變化具有細胞類型特異性。進一步研究發(fā)現(xiàn)writers、erasers 和readers 之間并非孤立作用，而是存在協(xié)同性，m6A 調控因子之間的串擾可能在COPD 的發(fā)生中起重要作用。此外，m6A調控因子，特別是METTL3、FTO、YTHDC2 和IGF2BP3，還可以間接與一些COPD關鍵基因相互作用，影響這些基因的表達，從而參與細胞對外源物質刺激的反應、脂質代謝等生物學過程，促進COPD 進展［19］?？偠灾?，該研究首次系統(tǒng)地證明了m6A 調控因子在COPD 中的表達和潛在功能，但其中具體的作用機制仍需進一步研究。

2.2 m6A 修飾與PH PH 是一種以肺動脈壓力升高為表現(xiàn)形式的血流動力學狀態(tài)，其定義為海平面、平臥靜息狀態(tài)下，經右心導管測量平均肺動脈壓力（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25mmHg。其中，低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是一種由肺部疾病引起的進展性疾病，常見病因為COPD 和間質性肺疾病。目前針對此類疾病尚無有效的治療方法［20］。

缺氧可導致m6A 修飾失調，從而促進疾病的發(fā)生發(fā)展，同時缺氧對m6A 修飾的影響具有細胞類型特異性［21］。既往對于circRNA 中的m6A 修飾知之甚少，但Zhou 等［21］鑒定出數千個細胞特異性表達的m6A 修飾的circRNA，擴大了人們對m6A 修飾理解的廣度，并揭示了m6A 修飾對circRNA 的調節(jié)。Wang等［22］首次通過基因芯片分析確定了HPH 小鼠模型肺組織中circRNA 的表達圖譜。在此基礎上，Su等［23］進一步研究發(fā)現(xiàn)，從HPH 大鼠肺組織中分離獲取的總circRNA 的m6A修飾水平低于正常對照組；近半數circRNA 跨越一個外顯子，并且來源于單個外顯子的circRNA 中存在豐富的m6A 修飾。雖然m6A修飾上調或下調的circRNA 的親本基因在蛋白質修飾過程中都富集，但兩者的作用途徑明顯不同。m6A修飾上調的circRNA 的親本基因主要在催產素信號通路、內質網蛋白加工、cGMP-PKG 信號通路及血管平滑肌收縮通路中富集，而下調的主要參與緊密連接和賴氨酸降解。與無m6A 修飾的circRNA 相比，m6A修飾的circRNA 在缺氧時有明顯減少的趨勢，這提示缺氧時m6A 可能下調circRNA 的表達［23］。circRNA具有miRNA 海綿的作用，可參與miRNA 相應靶基因的表達［24］。為探索circRNA-miRNA 調控對PH 相關基因表達的影響，研究者通過構建circRNA-miRNAmRNA 網絡，篩選了與Wnt［25］和FoxO［26］這2 條參與PH 進展的信號通路相關的關鍵mRNA 和miRNA，經檢測顯示circXpo6和circTmtc3變化最明顯。經RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）-PCR 證實，在低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞和內皮細胞中，m6A 修飾的circXpo6 和circTmtc3 表達顯著下調［23］?？傊撗芯康慕Y果表明m6A 修飾的circRNA 與PH有關，m6A 通過影響circRNA 的穩(wěn)定性，導致Wnt 和FoxO 信號通路激活，最終促進HPH 的發(fā)生發(fā)展［23］。然而，缺氧影響m6A 修飾的確切機制尚未得到證實，該研究也沒有詳細闡述m6A修飾在HPH中的作用。

2.3 m6A 修飾與肺癌 肺癌是一種由肺上皮細胞惡性增殖而形成的腫瘤。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，m6A修飾發(fā)揮著重要作用。m6A 相關蛋白表達的異常能導致非小細胞肺癌的增殖、侵襲、轉移和耐藥等。

上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的關鍵。最近有研究表明，METTL3在香煙煙霧提取物誘導的EMT 中起關鍵作用，它通過上調ZBTB4 mRNA 的m6A 修飾水平來誘導EMT 和肺癌的發(fā)生［27］。Xue 等［28］的研究啟發(fā)了我們對m6A 和lncRNA在肺癌中作用的理解：lncRNA ABHD11-AS1 在功能上可以促進非小細胞肺癌的增殖和Warburg效應，其異位過表達與非小細胞肺癌患者的不良預后密切相關，而METTL3可以通過增強ABHD11-AS1的轉錄穩(wěn)定性，上調其表達。此外，miR-600 和miR-33a 可通過抑制METTL3的表達，逆轉METTL3對非小細胞肺癌進展的積極作用［29］。

去甲基化酶FTO 是肺鱗癌的一個預后因素，過表達的FTO 通過降低MZF1 mRNA 的m6A 修飾水平和穩(wěn)定性來增強MZF1 的表達，從而發(fā)揮致癌作用［30］。過去我們認為ALKBH5 在非小細胞肺癌中呈異位上調，且與預后不良密切相關。但最近Jin 等［31］的研究表明，ALKBH5也可通過降低YTHDFs介導的YAP 表 達 和 抑 制miR-107/LATS2（large tumor suppressor kinase 2）介導的YAP 活性來抑制非小細胞肺癌的生長和轉移。綜上所述，ALKBH5 可抑制腫瘤進展，而FTO 促進腫瘤形成，若要具體闡明它們作用的差異，則需要進一步研究。

Sheng 等［32］觀察到YTHDF2 在非小細胞肺癌中表達上調，它通過直接與6-磷酸葡萄糖脫氫酶3′-UTR 的m6A 修飾位點結合，增強磷酸戊糖途徑，為癌細胞增殖提供能量。與之相反，YTHDC2 在非小細胞肺癌中表達下調，并且其低表達與腫瘤的低分化、淋巴結轉移、腫瘤大小和分期顯著相關，這表明YTHDC2 抑制非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展［33］。我們推測不同RNA 的m6A 修飾發(fā)生變化后，轉錄后調控方式的差異是RNA被不同的m6A結合蛋白選擇性識別所導致的。而m6A 結合蛋白如何選擇性識別，具體的分子機制仍需探索。

2.4 其 他 Dai 等［34］基 于WTAP、KIAA1429、YTHDC2、FMR1和ZC3H13這5個m6A 調控因子構建了預測兒童哮喘風險的模型，將哮喘兒童分為A 組和B 組，B 組的m6A 評分高于A 組，并且檢測到A 組患兒與輔助性T 細胞1 型的免疫相關，而B 組患兒與輔助性T 細胞2 型的免疫相關。另外，Kim 等［35］觀察到在人原代氣道上皮細胞中，F(xiàn)TO缺失會導致FOXJ1 mRNA 穩(wěn)定性降低，同時纖毛上皮細胞明顯減少，杯狀細胞增多；而FTO敲除的小鼠由于纖毛上皮細胞缺陷，在過敏原刺激下表現(xiàn)出強烈的哮喘樣表型。由此可見，m6A 調控因子在哮喘的發(fā)生中起著不可忽視的作用。

Han 等［36］在肺纖維化方面的研究顯示，碳黑處理后的大鼠肺組織中pri-miRNA-126 的m6A 修飾水平下調，阻礙了miRNA-126的成熟，進而激活其下游靶向調控基因PI3K介導的PI3K/AKT/mTOR 通路，引起肺組織纖維化。

在炎癥反應中，ALKBH5基因敲除可抑制靶細胞活力，誘導細胞調亡，減少炎癥細胞因子的產生［37］。此外，Zhao 等［38］的研究顯示ALKBH5 還可以下調IL6mRNA 的m6A 修飾水平，抑制其核質轉運，減輕放射性肺炎的損害。

3 m6A在肺部疾病中的潛在應用

3.1 m6A修飾可作為肺部疾病的生物標志物 特征性生物標志物在疾病的預防、診斷和治療中起著至關重要的作用。上述的研究已表明，m6A異常修飾會影響肺部疾病的進展。例如，在HPH 中，m6A 修飾的circXop6 和circTmtc3 顯著下調［23］。而circRNA 在特定的細胞類型或組織中有不同程度的富集，且不易降解，較miRNA、mRNA 等穩(wěn)定。隨著m6A 修飾檢測技術的創(chuàng)新，m6A修飾可作為一種有前景的肺部疾病診斷生物標志物。早期檢測到circRNA m6A 修飾水平的變化可能有助于監(jiān)測和預防疾病的發(fā)生發(fā)展。

3.2 m6A修飾可作為肺部疾病的治療靶點 越來越多的研究表明，m6A 修飾在肺部疾病中具有重要作用，為以相關甲基轉移酶、去甲基化酶、m6A結合蛋白或m6A修飾的RNA為靶點的創(chuàng)新治療方案提供了新見解。最近，Li 等［39］通過將一種催化失活的酶連接到ALKBH5 上，創(chuàng)造了一種融合蛋白dm6ACRISPR，它可以特異性地將靶轉錄本去甲基化。這種靶向調控m6A 修飾的融合蛋白有可能用于調節(jié)肺部疾病的基因表達和細胞功能。但目前針對m6A 修飾的治療方案仍處于初級階段，還有很多問題有待解決，如治療位點的選擇、治療的副作用和人類個體差異等。

4 問題與展望

m6A修飾是一個迅速發(fā)展的新興研究領域，盡管在調控機制和腫瘤方面的研究已有所進展，但是m6A修飾調控基因的機制是復雜的，不同細胞中的機制也不盡相同，因此需要研究者們進一步研究其在病理狀態(tài)下確切的變化和作用機制。目前m6A 修飾在肺部疾病中的研究較少，特別是在COPD等慢性肺疾病中的確切作用仍不清楚，因此m6A 修飾在肺部疾病相關領域的研究需進一步深入，以期其能夠成為臨床評估和診治疾病的生物標記物及治療靶點。