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    抗體模擬物及多肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景①

    2021-03-29 06:22:23譚小艷李翀顧大勇何建安龍軍南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科廣州510280
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年13期
    關(guān)鍵詞:環(huán)肽殘基多肽

    譚小艷 李翀 顧大勇 何建安 龍軍(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,廣州510280)

    抗體是一類重要的生物藥物,由于它們與抗原的高親和力和特異性的相互作用及單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展,在臨床治療和診斷方面起著舉足輕重的作用,但也存在許多局限性,如藥代動(dòng)力學(xué)不足、組織可及性差、免疫原性不良和生產(chǎn)成本高,且抗體分子量大,穿透性差,限制了其廣泛使用。目前,針對(duì)目標(biāo)抗原的合成多肽及多肽的模擬物是抗體的重要替代品,如來(lái)源于互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region,CDR)的某些小分子多肽可以替代其源抗體,發(fā)揮與完整抗體相同的生物功能和特異性結(jié)合[1-2]??贵w模擬技術(shù)是在20世紀(jì)90年代才發(fā)展起來(lái)的一種新興技術(shù),有文獻(xiàn)稱,CDR區(qū)的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸序列在抗體與抗原的界面相互作用及特異性結(jié)合之間占據(jù)著重要地位,尤其是免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(HCDR3)區(qū),基因的連接、組合和重排機(jī)制,成為人類抗體庫(kù)廣泛多樣性的原因[3]。因此如果將該結(jié)合部位的氨基酸殘基分離出來(lái),并通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬及化學(xué)合成的方式維持其在結(jié)合位點(diǎn)上的空間構(gòu)象,尤其是CDR區(qū)的轉(zhuǎn)角構(gòu)型,在維持抗體的功能和特異性方面起著非常重要的作用,理論上能夠得到與抗原特異性結(jié)合的小分子抗體模擬物[4]。

    1 抗體的結(jié)構(gòu)及其與抗原結(jié)合的特點(diǎn)

    抗體是免疫系統(tǒng)受刺激后產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì),其作用是靶向中和病原體和毒素。抗體呈Y字型的四聚體結(jié)構(gòu),含兩條相同的重鏈和兩條輕鏈。Y字的頂端由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成,在可變區(qū)有小部分氨基酸變化特別強(qiáng)烈且其殘基和排列順序等易發(fā)生變異,該位置被稱為高變區(qū),也即CDR區(qū)[5-6]。另外,抗體可經(jīng)木瓜蛋白酶水解成一個(gè)結(jié)晶片段(Fc片段)和兩個(gè)抗原結(jié)合片段(Fab片段),抗體的主要治療是基于抗蛋白質(zhì)的抗體阻斷蛋白質(zhì)的配體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)——配體相互作用,該作用由抗體的可變區(qū)(Fv)介導(dǎo)。另一方面,抗體的細(xì)胞毒性作用與其Fc結(jié)構(gòu)域相關(guān),其通過(guò)與自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞上的Fc受體,以及補(bǔ)體蛋白的相互作用誘導(dǎo)靶細(xì)胞裂解[7-8]。

    不同抗體CDR區(qū)的氨基酸殘基種類、數(shù)量和氨基酸序列各不相同。由于抗體具有多樣性的巨大潛力,HCDR3被認(rèn)為是抗體分子在賦予結(jié)合活性和特異性方面最重要的成分,尤其是HCDR3空間構(gòu)象(如β-轉(zhuǎn)角、環(huán)狀結(jié)構(gòu)等)的多樣性與抗體的多樣性密切相關(guān)。因此,HCDR3成為獨(dú)特的標(biāo)識(shí)符,用于研究體內(nèi)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。如齊靜等[9]以抗P-糖蛋白單克隆抗體(PMHA02)為模板,通過(guò)單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)的方式,在該抗體的HCDR3區(qū)β轉(zhuǎn)角插入半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及芳香族氨基酸修飾的環(huán)肽(據(jù)報(bào)道,其可以增加抗原與抗體結(jié)合的穩(wěn)定性,并維持CDR樣轉(zhuǎn)角構(gòu)型[10]),由此設(shè)計(jì)了抗P-糖蛋白抗體的十四環(huán)肽模擬物,并證實(shí)該抗P-糖蛋白抗體肽模擬物可以與PMHA02抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合K562/A02細(xì)胞,也就是說(shuō)該模擬物對(duì)P-糖蛋白具有相同結(jié)合活性。

    2 小分子抗體模擬物及多肽的應(yīng)用

    2.1 CDR來(lái)源性多肽以多肽、蛋白質(zhì)類治療劑為先導(dǎo)物,利用化學(xué)合成的方法合成蛋白質(zhì)多肽類治療劑的非肽小分子模擬物可解決蛋白質(zhì)、多肽類治療劑存在的缺點(diǎn)。這種小分子模擬物保持先導(dǎo)物藥效基團(tuán)的有效空間排布及其功能構(gòu)象,因此具有與先導(dǎo)物相同的生物功能[11-13]。有大量證據(jù)表明HCDR3是抗體結(jié)合特異性的主要決定因素,如:從合成抗體文庫(kù)中選擇特異性抗體,其多樣性僅限于HCDR3。有文獻(xiàn)稱,僅相同的文庫(kù)與LCDR3多樣性組合時(shí),從含有HCDR3多樣性的合成文庫(kù)中能選擇更多數(shù)量的抗體,進(jìn)一步證實(shí)了HCDR3在抗體多樣性方面的重要性[14-15]。PERSSON等[16]在重鏈(CDRH3)和輕鏈(CDR-L3)的第三互補(bǔ)決定區(qū)中構(gòu)建了具有相同化學(xué)多樣性的合成噬菌體展示抗體庫(kù),由于產(chǎn)生抗體編碼基因的遺傳機(jī)制,CDR-H3比CDRL3更加多樣化。更令人驚訝的是,合成的組庫(kù)產(chǎn)生了許多功能性抗體,這些功能性抗體都具有固定的CDR-H3序列。另外,在識(shí)別10種不同抗原的丙氨酸掃描分析中發(fā)現(xiàn),含有共同且固定的CDR-H3環(huán)的抗體序列能夠有力地促進(jìn)抗原識(shí)別。以上結(jié)果與從天然抗體分析得到的抗原識(shí)別觀點(diǎn)形成對(duì)比,該學(xué)者推測(cè)在抗原識(shí)別的過(guò)程中,抗體的CDR-H3環(huán)起主要作用,而CDR-L3起輔助作用。

    除展示文庫(kù)外,具有限于HCDR3的抗體多樣性的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在體內(nèi)產(chǎn)生高親和力反應(yīng)[5]。進(jìn)一步的證據(jù)表明,HCDR3是抗體結(jié)合特異性的主要決定因素,這是由于從HCDR3結(jié)構(gòu)中提取的肽可以表現(xiàn)出抗體的生物活性,甚至有案例表明這種提取的多肽能達(dá)到治療性抗體的作用,如TIMMERMAN等[17]利用CDR區(qū)構(gòu)建抗胃泌素G17的多肽藥物,眾所周知,胃泌素肽是調(diào)節(jié)胃酸分泌的激素,并且可以作為胰腺癌、胃癌和結(jié)腸、直腸癌的生長(zhǎng)因子。胃 泌 素17(pyroEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2,G17)是最具生物活性的形式之一,這使得它成為開(kāi)發(fā)治療性抗體的一個(gè)有趣的靶點(diǎn)。因此該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)用苯環(huán)結(jié)構(gòu)的基質(zhì)平臺(tái)將輕鏈及重鏈可變區(qū)的幾段序列互配,合成雙環(huán)肽、單環(huán)肽、三環(huán)肽等結(jié)構(gòu),利用此結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)了相關(guān)性好的抗胃泌素結(jié)合物。其中含CDR3區(qū)的雙環(huán)肽經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有較高的OD值,三環(huán)肽經(jīng)表面等離子共振體(surface plasmon resonator,SPR,利用光學(xué)折射的原理檢測(cè)生物傳感芯片上配體與分析物之間相互作用的情況)檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度最高。

    因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下,天然來(lái)源的CDR3肽表現(xiàn)出很低的活性和親和力,因此需要對(duì)其序列進(jìn)行分析以解決多肽缺乏抗體結(jié)構(gòu)域問(wèn)題。在QIU等[18]的研究中,通過(guò)篩選溶菌酶免疫的噬菌體展示VHH文庫(kù),在側(cè)翼鑒定了具有框架3(FR3)和FR4的CDR3結(jié)構(gòu)域抗體。該抗體具有有效的酶抑制活性和高熱穩(wěn)定性。通過(guò)序列比對(duì)和定點(diǎn)誘變分析,發(fā)現(xiàn)FR3中氨基酸位置為88處的半胱氨酸殘基可能在維持CDR3抗體的穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用。另外,KADAM等[19]利用CR9114和FI6V3這兩個(gè)可以結(jié)合在流感病毒血凝素中間部分的保守位點(diǎn)的廣泛中和抗體來(lái)合成肽段,因CR9114的作用位點(diǎn)在CDR區(qū)及框架區(qū),而FI6V3作用點(diǎn)為CDR區(qū),因此選擇CR9114的框架區(qū)及FI6V3的CDR區(qū),中間用非蛋白質(zhì)氨基酸連接后形成肽段,該多肽具有空間構(gòu)象,應(yīng)用于檢測(cè)特異性良好。證實(shí)小分子CDR3結(jié)構(gòu)域抗體可以作為親和力轉(zhuǎn)移的新支架,因此對(duì)理解抗原——抗體相互作用有著實(shí)質(zhì)性的指導(dǎo)意義。

    2.2 非CDR源性多肽抗體是一類重要的生物藥物,但存在局限性,如藥代動(dòng)力學(xué)不足,免疫原性不良和生產(chǎn)成本高。針對(duì)目標(biāo)的合成多肽是抗體的重要替代品,然而,肽的設(shè)計(jì)需要計(jì)算工具來(lái)指導(dǎo)設(shè)計(jì)。為了識(shí)別特定抗體-抗原(Ab-Ag)界面的相互作用殘基,VIART等[20-21]采用了界面相互作用殘基(I2R),一種基于分子相互作用計(jì)算的選擇方法。表位和互補(bǔ)位殘基之間所有分子相互作用的聚集使其能夠?qū)⑷SAb-Ag復(fù)合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為界面圖?;谶@些數(shù)據(jù)和分子相互作用的概率,開(kāi)發(fā)了表位-互補(bǔ)位相互作用的多肽設(shè)計(jì)工具(EPI-Peptide Designer),該工具使用預(yù)測(cè)的互補(bǔ)位殘基作為目標(biāo)表位以產(chǎn)生靶向肽配體文庫(kù)。并且使用EPI-Peptide Designer成功預(yù)測(cè)了301種能夠與LiD1靶蛋白(一種在棕色蜘蛛Loxosceles的毒液腺中表達(dá)且具有皮膚壞死活性的蛋白質(zhì)[22-23])結(jié)合的肽(65%能與LiD1結(jié)合),比隨機(jī)產(chǎn)生的肽高出22%的結(jié)合率。該工具應(yīng)該能夠開(kāi)發(fā)新一代合成相互作用肽,這些肽在生物傳感器,診斷和治療領(lǐng)域非常有用。

    除此之外還有非CDR源性多肽,如噬菌體展示肽文庫(kù)可通過(guò)多種方式在其表面展示不同的肽,①可以利用已知的蛋白質(zhì)折疊(如鋅指折疊、芋螺毒素折疊、免疫球蛋白折疊或胱氨酸結(jié)),在這些三級(jí)折疊上隨機(jī)接枝寡肽;②利用巰基反應(yīng)性化合物或交聯(lián)劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾,在篩選前對(duì)顯示肽段進(jìn)行有限的環(huán)化和衍生化(如用兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵形成簡(jiǎn)單的環(huán)肽);③通過(guò)改變環(huán)大小和氨基酸手性、加入限制性結(jié)構(gòu)單元或者修改某個(gè)殘基從而在環(huán)肽區(qū)域引入附著手柄,能夠在獲得具有重要意義的結(jié)合肽的同時(shí),使得其結(jié)合親和力和特異性得 到 進(jìn) 一 步 改 善[24]。如KHASRAW等[25]通 過(guò) 在RGD環(huán)肽(RGD可與整合素特異性結(jié)合,能有效地促進(jìn)細(xì)胞對(duì)生物材料的黏附)上引入受約束的結(jié)構(gòu)單元如N-甲基化氨基酸,從而發(fā)現(xiàn)了一種具有序列的頭尾環(huán)肽——西侖吉肽,其臨床研究中表明西侖吉肽在小鼠中具有明顯的腫瘤消退作用,同時(shí)它還是復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的潛在單藥治療;MAASS等[26]獲得的結(jié)合于CTLA-4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的胱氨酸-結(jié)肽(CTLA-4為T淋巴細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體)已成為治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤的靶標(biāo)。胱氨酸結(jié)(也稱為knottins)是小而緊湊的肽(通常為20~60個(gè)氨基酸),由至少3個(gè)二硫鍵的核心組成,它們交織成“結(jié)”構(gòu)象,將含有4個(gè)環(huán)的環(huán)狀物與神經(jīng)曲霉素偶聯(lián),融合到抗體Fc結(jié)構(gòu)域或結(jié)合蛋白的寡聚結(jié)構(gòu)域,使離解常數(shù)在納米范圍內(nèi)增強(qiáng)。

    多肽及其模擬物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是引入新的生物活性或者以小分子還原劑發(fā)揮源抗體的功能作用。NIMROD[27]提出了一種通過(guò)關(guān)注功能性表位來(lái)設(shè)計(jì)功能性抗體的計(jì)算方法,將大規(guī)模統(tǒng)計(jì)分析與多種結(jié)構(gòu)模型相結(jié)合,設(shè)計(jì)了一種功能性抗體以抵抗細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17A(interleukin,IL-17A)的促炎作用?;诩?xì)胞的分析證實(shí)抗體是有功能的,X射線晶體學(xué)證實(shí)設(shè)計(jì)的抗體可以結(jié)合靶向表位,并且其相互作用由設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)介導(dǎo)。重要的是,這種方法不依賴于設(shè)計(jì)復(fù)雜的高質(zhì)量3D模型或甚至目標(biāo)的解決結(jié)構(gòu)。且該方法可用于設(shè)計(jì)生物活性抗體,消除抗體設(shè)計(jì)和藥物發(fā)現(xiàn)中的一些主要障礙。

    3 展望

    在過(guò)去的十年中,批準(zhǔn)臨床使用的抗體數(shù)量急劇增加,利用多肽代替抗體具有制造成本低、免疫原性低、穩(wěn)定性好、器官/腫瘤穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上,目前許多研究工作都集中利用肽模擬物作為抗體的一種可行的替代靶向治療,或者是應(yīng)用于藥理學(xué)基礎(chǔ)研究,在臨床診斷應(yīng)用方面尚缺乏有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持,因此還需要進(jìn)一步對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行探索,在氨基酸分子水平上繼續(xù)研究多肽抗體與抗原之間的相互作用,探究抗體的部分氨基酸殘基及結(jié)構(gòu)對(duì)抗原的結(jié)合力產(chǎn)生的影響,并利用該技術(shù)合成與源抗體發(fā)揮相同作用的高活性多肽抗體模擬物,以期將該模擬物應(yīng)用于臨床診斷。

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