新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展*

王 靜 綜述,米弘瑛 審校

(1.大理大學(xué)，云南大理671003；2.云南省第一人民醫(yī)院兒科，昆明 650032;3.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院，昆明 650032)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒期最常見且病死率較高的外科急危重癥，多發(fā)于早產(chǎn)兒，以嘔吐、腹脹、血便為典型的臨床表現(xiàn)。美國和加拿大的多中心新生兒網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫顯示，出生體重500～1 500 g的早產(chǎn)兒中，NEC的發(fā)生率為7%，病死率為20%～30%，近幾年無明顯改善[1-3]。有研究揭示NEC的發(fā)生與新生兒腸道動(dòng)力和腸道黏膜屏障不成熟、免疫系統(tǒng)的易感性、腸道微生物不成熟與失衡、喂養(yǎng)不當(dāng)?shù)扔嘘P(guān)[4-8]，目前國內(nèi)外研究尚未能闡明NEC的發(fā)病機(jī)制。

1 既往研究

新生兒NEC是由多種因素導(dǎo)致的腸道炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常常與膿毒血癥、全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、循環(huán)衰竭等全身炎癥性疾病密切相關(guān)，其中早產(chǎn)和感染是其獨(dú)立相關(guān)的危險(xiǎn)因素，尤其由革蘭陰性菌引起的膿毒癥伴發(fā)NEC時(shí)，病情較危重，腸穿孔發(fā)生率及病死率較高[9-11]。既往臨床研究顯示：NEC小鼠回腸組織Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)4及核因子-κB(NF-κB)表達(dá)升高,以及TLR9表達(dá)下降,提示TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)活化是導(dǎo)致NEC發(fā)病的重要機(jī)制之一[12-13]。由腸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，尤其是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、血小板活化因子和一氧化氮(NO)在NEC炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[14]。已證實(shí)血小板活化因子能夠誘導(dǎo)TLR4的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)，并募集大量炎性細(xì)胞及補(bǔ)體參與腸黏膜上皮的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。

腸道炎性反應(yīng)常引起腸道黏膜上皮彌漫性水腫、缺血、壞死、脫落等病理改變，嚴(yán)重者導(dǎo)致腸穿孔，引起急性腹膜炎、彌散性血管內(nèi)凝血、膿毒癥性休克、多器官功能障礙等并發(fā)癥。臨床上多以禁食、胃腸減壓、營養(yǎng)支持、抗感染、維持水電解質(zhì)及酸堿平衡、糾正凝血功能障礙等治療為主[16]，對(duì)危重患兒采取外科手術(shù)治療[17-18]，目前尚無特異性治療方案。消皮素D(gasdermin D，GSDMD)的發(fā)現(xiàn)，無疑為探索新生兒NEC的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供了新的研究方向。

2 研究新進(jìn)展

2.1 由GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能參與NEC的炎癥機(jī)制

新生兒NEC是多種因素相互作用的結(jié)果，因其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前臨床上尚無突破性的有效治療方案，導(dǎo)致其病死率較高、預(yù)后較差。隨著GSDMD家族的發(fā)現(xiàn)及研究的深入，GSDMD分子機(jī)制和在炎癥中的作用逐漸被廣泛認(rèn)識(shí)。細(xì)胞焦亡是由GSDMD介導(dǎo)的一種特殊的程序性細(xì)胞死亡機(jī)制，無論在壞死機(jī)制上還是在細(xì)胞死亡形態(tài)上的分析，均與細(xì)胞凋亡和其他類型的細(xì)胞壞死不同。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD作為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1、caspase-4、caspase-5及caspase-11的下游分子，被切割成有活性的N-端結(jié)構(gòu)域和無活性的C-端結(jié)構(gòu)域，有活性的N-端結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上特定的磷脂分子如磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰絲氨酸和心磷脂等結(jié)合，介導(dǎo)非離子選擇性孔道的形成，耗散細(xì)胞內(nèi)外的離子滲透梯度[19-22]；而被磷酸化激活的混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)同時(shí)與質(zhì)膜結(jié)合形成可滲透的離子通道，二者共同發(fā)揮成孔作用改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡[23]，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹和崩解死亡,最后釋放出IL-1β等炎性介質(zhì)發(fā)揮致炎作用[24]，同時(shí)將細(xì)胞內(nèi)的微生物暴露出來，有利于機(jī)體對(duì)病原微生物的清除，在介導(dǎo)細(xì)胞裂解的過程中MLKL分子也發(fā)揮了重要作用。

在細(xì)胞焦亡的過程中，GSDMD是如何精確調(diào)控細(xì)胞死亡、如何參與NEC的發(fā)病及探索GSDMD特異性抑制分子是未來研究的重點(diǎn)方向。CHEN等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD-N端存在α-螺旋結(jié)構(gòu)，而MLKL中的N-末端也存在這種結(jié)構(gòu)，這是MLKL齊聚和功能所必需的，因此，這種α結(jié)構(gòu)可能是GSDMD-N端寡聚和細(xì)胞死亡所必需的，推測(cè)破壞這種結(jié)構(gòu)就可能會(huì)抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生。相關(guān)研究顯示，caspase-1、IL-1β、IL-18、NLRP3等與細(xì)胞焦亡相關(guān)的分子在腸上皮及小鼠NEC模型中顯著高表達(dá)，從而提出細(xì)胞焦亡可能參與新生兒NEC的發(fā)病機(jī)制，且GSDMD基因有望成為治療NEC的靶基因位點(diǎn)[25]。

GSDMD不僅是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子，還參與中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn)，這兩種細(xì)胞死亡方式均在NEC的腸黏膜上皮炎性反應(yīng)中發(fā)揮不可或缺的作用。

2.2 NETs在NEC發(fā)生、發(fā)展中的作用

NETs是依賴于GSDMD形成的一種中性粒細(xì)胞死亡的特殊形式，它將細(xì)胞核DNA去致密化，隨后排出染色質(zhì)，染色質(zhì)被細(xì)胞毒性顆粒蛋白包裹，如髓過氧化物酶(MPO)、彈性蛋白酶和其他蛋白酶等，這些被特殊修飾的染色質(zhì)和其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被稱為NETs，這個(gè)過程也被稱作NETosis[26-27]。最新研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD在NETs的形成中發(fā)揮重要作用，在中性粒細(xì)胞中，GSDMD被包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)在內(nèi)的絲氨酸蛋白酶裂解，由被切割后的GSDMD-N端結(jié)構(gòu)域的成孔作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28]，在NETosis的過程中，GSDMD-N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上形成孔以允許NETs的釋放[29-30]。除此之外，NETosis的發(fā)生與乙酸肉豆蔻酸佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)也密不可分[31]，PMA通過Nox依賴途徑誘導(dǎo)NETosis的發(fā)生，還能引起補(bǔ)體蛋白的最大釋放。無論是這種中性粒細(xì)胞的特殊死亡，還是大量炎性物質(zhì)及補(bǔ)體成分的釋放，均可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)呈瀑布式的爆發(fā)。目前這種NETs的特殊死亡形式已經(jīng)被證實(shí)參與了NEC的發(fā)病[30]，但其在NEC中具體的信號(hào)通路仍然不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

既往研究表明，中性粒細(xì)胞表面抗原CD64被證實(shí)對(duì)鑒別早發(fā)型和晚發(fā)型敗血癥及NEC具有良好的診斷價(jià)值[32]。通過比較CD64和C反應(yīng)蛋白的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)CD64在LOS/NEC中是一個(gè)比C反應(yīng)蛋白好得多的早期預(yù)警生物標(biāo)記物[33-34]?？傊行粤＜?xì)胞CD64表達(dá)作為一種監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物，對(duì)識(shí)別極低出生體重兒LOS/NEC既靈敏(89%)又特異(98%)[35]。只是CD64在NEC診斷過程中具體的參考值范圍尚不清楚,其在NEC中的具體作用也未被完全詳細(xì)闡明。由此推測(cè)，在NEC的發(fā)病過程中，可能存在早期預(yù)警的生物標(biāo)記物。

2.3 GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞焦亡與NETSs的發(fā)生的機(jī)制

作為同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡及NETs這兩種程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵分子，GSDMD是如何介導(dǎo)細(xì)胞焦亡與NETs的發(fā)生？這兩種機(jī)制是否只是在同一細(xì)胞死亡過程中的不同階段，即細(xì)胞膜完整性被GSDMD-N端結(jié)構(gòu)的成孔作用破壞導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，在細(xì)胞膜被破壞后釋放細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)及其他蛋白成分形成NETs，二者共同發(fā)揮作用；還是GSDMD通過不同的受體與配體結(jié)合作用于不同的細(xì)胞，獨(dú)立介導(dǎo)細(xì)胞焦亡和NETs的發(fā)生。有學(xué)者提出，在感染早期NETs的形成涉及中性粒細(xì)胞[36]，但中性粒細(xì)胞不發(fā)生溶解并保持多種任務(wù)能力，與上述設(shè)想有沖突，還有待于進(jìn)一步深入研究。但針對(duì)GSDMD基因的特異性抑制因子阻止其表達(dá)可以阻斷細(xì)胞焦亡和NETs的發(fā)展過程是毫無疑問的。新生兒NEC的發(fā)病多伴隨著膿毒癥，感染、細(xì)胞焦亡、NETs等多種機(jī)制可能相互作用，形成惡性循環(huán)，而GSDMD是多種機(jī)制中的關(guān)鍵，阻斷其基因表達(dá)有可能打破這種惡性循環(huán)，為治療新生兒NEC提供新的理論依據(jù)。

3 展 望

由GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和NETs在NEC發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受關(guān)注，近年來已有學(xué)者在研究能夠阻斷GSDMD基因表達(dá)的特異性抑制分子，并試圖闡述其信號(hào)分子通路，揭示其在NEC中的具體參與機(jī)制，但目前還無實(shí)質(zhì)性的突破。雖然在研究過程中也發(fā)現(xiàn)了有早期監(jiān)測(cè)意義的生物化學(xué)指標(biāo)，但還需臨床上的進(jìn)一步篩選。如能發(fā)現(xiàn)可以用來監(jiān)測(cè)NEC的特異性生物化學(xué)指標(biāo)，并且研究出GSDMD的有效特異性抑制分子，就可以做到早期診斷、早期治療，從而提高NEC的臨床治愈率并改善預(yù)后。