嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）在疾病治療中的研究進(jìn)展

孫 強(qiáng) 金宇亭 黃 晶

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長(zhǎng)春130000）

嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法自產(chǎn)生以來(lái)，在臨床治療中發(fā)揮重要作用，尤其對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)是一種有效的治療手段［1-2］。目前利用CAR-T 技術(shù)治療的血液系統(tǒng)腫瘤包括急性髓系白血病、急性淋巴系白血病、慢性髓系白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，并且在治療肝癌、前列腺癌等實(shí)體瘤中也具有一定的效果［3-5］。近年來(lái)，CAR-T 細(xì)胞免疫療法在治療自身免疫疾病、心臟病等方面也初見(jiàn)成效。該技術(shù)不僅明顯改善了患者的預(yù)后，而且還極大地提高了患者的生活質(zhì)量，為更多的患者帶來(lái)福音［6］。

1 CAR-T生物學(xué)特征

1.1 CAR-T 結(jié)構(gòu) CAR-T 是由單克隆抗體的單鏈可變區(qū)（single chain variable region，scFv）和T 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)連接而成，針對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞抗原構(gòu)建不同的單克隆抗體代替T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）中的互補(bǔ)決定區(qū)，避免主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性，CAR 中scFv 通過(guò)特異性識(shí)別腫瘤特異性抗原直接將信號(hào)傳到T 細(xì)胞內(nèi)，使T 細(xì)胞活化，分泌細(xì)胞因子，殺滅腫瘤細(xì)胞［7］。與TCR 相比，CAR抗體能夠識(shí)別更廣泛的相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞抗原，以MHC 非限制性方式使T 細(xì)胞活化，進(jìn)而發(fā)揮高效性和特異性的抗腫瘤效應(yīng)［8-9］。

CAR 作為CAR-T 的核心，其結(jié)構(gòu)主要由胞外區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)四部分組成［10］。胞外區(qū)通常由針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）的單克隆抗體的輕鏈及重鏈連接而成［11］。鉸鏈區(qū)針對(duì)不同腫瘤相關(guān)抗原需要調(diào)整鉸鏈區(qū)長(zhǎng)度，以便更好地發(fā)揮靶向結(jié)合能力，因此鉸鏈區(qū)對(duì)于腫瘤相關(guān)抗原的識(shí)別很重要?？缒^(qū)常由CD3、CD8、CD28 的跨膜區(qū)構(gòu)建，在T 細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)主要由如CD28、CD134、CD137 等組成。CAR 大體結(jié)構(gòu)由膜外段和膜內(nèi)段組成，膜外段主要是抗原來(lái)源的抗原結(jié)合的單克隆抗體可變區(qū)，膜外段由刺激結(jié)構(gòu)域和共刺激結(jié)構(gòu)域組成［12］。目標(biāo)靶抗原的選擇對(duì)于CAR 的特異性是關(guān)鍵性因素，隨著CAR-T 的廣泛應(yīng)用，其演化過(guò)程也不斷優(yōu)化。

1.2 CAR-T 分類(lèi) CAR-T 根據(jù)CAR 胞內(nèi)區(qū)組成的不同，可將其分為四代：①第一代：胞內(nèi)只有1 個(gè)激活結(jié)構(gòu)域，即免疫受體酪氨酸活化基序（immune receptor tyrosine activated motif，ITAM），ITAM 活化后可激活下游序列，分泌低水平的細(xì)胞因子，產(chǎn)生較低的抗腫瘤作用，為了克服這一不足之處，產(chǎn)生了第二代CAR-T［13］。②第二代：胞內(nèi)有1 個(gè)激活結(jié)構(gòu)域和一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，即在第一代的基礎(chǔ)上加入了CD28共刺激結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生更強(qiáng)的刺激信號(hào)活化T細(xì)胞，大量的細(xì)胞因子產(chǎn)生，提高了T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而加強(qiáng)抗腫瘤作用［14-15］。與第一代CAR-T 相比，第二代CAR-T 能夠增加對(duì)腫瘤細(xì)胞裂解的記憶效應(yīng)以及CAR-T 介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)［16］。為了進(jìn)一步提高T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、增殖活性和存活時(shí)間，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，第三代CAR-T 應(yīng)運(yùn)而生。③第三代：有1 個(gè)激活結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，即在第二代的基礎(chǔ)上加入了CD137 共刺激結(jié)構(gòu)域，活化T 細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，發(fā)揮更強(qiáng)更持久的抗腫瘤效應(yīng)［17-18］。④第四代：又稱(chēng)TRUCK T 細(xì)胞（T-cell redirected for universal cytokine killing，TRUCK），在第二代的基礎(chǔ)上添加IL-12，含有1個(gè)活化T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of the activated T cell，NFAT）轉(zhuǎn)錄相應(yīng)元件，使CAR-T 在腫瘤區(qū)域分泌IL-12，從而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，募集并活化其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫殺傷［19］。

1.3 CAR-T 技術(shù)原理 CAR-T 免疫療法是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法。CAR-T 將抗原抗體的特異性和T 細(xì)胞的高效殺傷作用結(jié)合，針對(duì)不同的腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)性抗原以及腫瘤基質(zhì)細(xì)胞表面特異抗原，采用基因工程改造患者的T 細(xì)胞，通過(guò)基于熒光素酶的TOPANGA 試劑對(duì)CAR 的表達(dá)進(jìn)行分離檢測(cè)，在體外大量培養(yǎng)生成特異性CAR-T，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，最終達(dá)到治愈的目的［20-24］。近年來(lái)，CAR-T免疫療法除在治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤方面取得關(guān)鍵性突破外，也被用來(lái)治療實(shí)體瘤、自身免疫病和心臟病等疾病，具有更廣闊的應(yīng)用空間，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要里程碑。

2 CAR-T的臨床應(yīng)用

2.1 CAR-T治療血液系統(tǒng)腫瘤

2.1.1 白血病 白血病是一種起源于造血干細(xì)胞的高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)FAB（法-美-英）協(xié)作組將白血病分為急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL），在人體造血過(guò)程中，各分化發(fā)育階段的B 淋巴細(xì)胞均表達(dá)特異性的分化抗原，如CD19、CD20 等，而且針對(duì)這些抗原分子的單抗本身也具有顯著的抗腫瘤作用，并已在臨床得到證實(shí)且廣泛應(yīng)用［25-26］。體外構(gòu)建CD19-CAR-T 對(duì)于ALL 已經(jīng)取得較好的療效。一些研究表明CD33、CD123 等AML 分化抗原作為CAR-T 作用靶點(diǎn)，構(gòu)建CAR-T將有望治愈AML［27］。

2.1.2 其他血液系統(tǒng)腫瘤 研究發(fā)現(xiàn)第三代CD19-CAR-T 治愈非霍奇金淋巴瘤已取得進(jìn)展［28］。針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的潛在靶點(diǎn)有CD138、CD38、CD56，報(bào)道稱(chēng)，靶向B 細(xì)胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）的CAR-T用于治療MM，并證實(shí)了CAR-T 對(duì)MM 細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性［29］。 同時(shí)，一些新的靶點(diǎn)如CD38、CD319（SLAMF7），已進(jìn)入臨床研究階段，為治愈其他B細(xì)胞腫瘤帶來(lái)了福音［30］。

2.2 CAR-T治療實(shí)體腫瘤

2.2.1 肝癌 乙型肝炎病毒感染者更易發(fā)生肝硬化和肝癌，清除HBV 才能有效阻止肝癌的發(fā)生。HBV復(fù)制以共價(jià)的閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA為模板，因此構(gòu)建具有共價(jià)環(huán)狀DNA 的CAR-T，DNA 特異性的CAR-T 可定位病毒感染的肝臟部位，特異性識(shí)別殺滅HBV 復(fù)制，從而發(fā)揮強(qiáng)烈的抗腫瘤效應(yīng)［31］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白（alpha-fetal protein，AFP）作為肝癌的特異性標(biāo)志物，構(gòu)建AFP-CAR-T 可有效進(jìn)行抗腫瘤反應(yīng)，為肝癌免疫治療提供新途徑［32］。

2.2.2 前列腺癌 前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是一種由前列腺上皮細(xì)胞分泌的蛋白酶，是診斷前列腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，據(jù)此構(gòu)建抗PSA-CAR-T，特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)PSA的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［33］。

2.2.3 卵巢癌 葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）在卵巢癌中異常表達(dá)，但在正常組織中很少表達(dá)，因此靶向FR 的CAR-T，其產(chǎn)生細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-4 和TNF-α 等，從而進(jìn)一步增加CAR-T 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的識(shí)別，卵巢癌細(xì)胞可被特異性溶解［34-35］。糖蛋白抗原CA125，又稱(chēng)MUC16，是診斷早期卵巢癌的重要指標(biāo)，目前針對(duì)該靶抗原的CAR-T 的研究已初見(jiàn)成效［36］。研究表明，將靶向卵巢癌腫瘤抗原受體酪氨酸激酶樣孤兒受體-1（the receptor tyrosine kinase-like orphan receptors-1，ROR1）的CAR-T 包埋于鎳鈦薄膜中可阻止腫瘤生長(zhǎng)，此方法還需更多的臨床驗(yàn)證［37］。

2.3 CAR-T 治療其他疾病 CAR-T 免疫療法可以治療自身免疫性疾病方面的研究已有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)基因修飾表達(dá)靶向CD19 的CAR-T 可以殺死狼瘡小鼠模型中的B 細(xì)胞，這種療法可以根除B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體并延長(zhǎng)生命［38］。此外，有報(bào)道稱(chēng)，CAR-T 可以靶向移除促進(jìn)心肌纖維化的活化的成纖維細(xì)胞，顯著降低心肌纖維化并恢復(fù)心臟功能［39］。

3 CAR-T存在的問(wèn)題及展望

綜上所述，CAR-T對(duì)治愈CD19表達(dá)陽(yáng)性的B細(xì)胞系血液腫瘤具有較好的療效，為治療腫瘤開(kāi)辟新篇章。但CAR-T 免疫療法亦有不足之處，由于某些特定的靶抗原在正常組織細(xì)胞存在，受到CAR-T 的攻擊導(dǎo)致?lián)p傷的脫靶效應(yīng)。此外，輸入的CAR-T 殺滅腫瘤細(xì)胞時(shí)，釋放大量的細(xì)胞因子造成細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），同時(shí)，被殺傷的腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放大量細(xì)胞因子造成腫瘤溶解綜合征［40-41］。由于實(shí)體瘤存在包膜，T細(xì)胞殺傷作用釋放的細(xì)胞因子難以進(jìn)入細(xì)胞，治療效果還不夠成熟，因而，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境成為研究熱點(diǎn)。報(bào)道稱(chēng)將CAR-T 和PD-1 聯(lián)合可以有效克服治療實(shí)體瘤的困難［42-43］。研究發(fā)現(xiàn)，基于納米抗體的CAR-T可殺死黑色素腫瘤細(xì)胞，顯著減緩腫瘤生長(zhǎng)［44］。CAR-T 在對(duì)抗實(shí)體瘤細(xì)胞時(shí)存在T 細(xì)胞衰竭現(xiàn)象，為克服此現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)Nr4a 轉(zhuǎn)錄因子蛋白在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞衰竭方面起著突出作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用缺乏Nr4a 轉(zhuǎn)錄因子的CAR-T 治療小鼠的腫瘤體積明顯減小，生存率明顯提高［45］。

總之，CAR-T 能精準(zhǔn)地殺傷靶細(xì)胞，具有多靶向殺傷，殺傷范圍廣，效果更持久等特點(diǎn)。然而，仍有許多挑戰(zhàn)需要考慮。隨著CAR 技術(shù)基礎(chǔ)和臨床研究的深入，CAR-T 免疫療法在治療疾病研究領(lǐng)域仍具有很大的潛在價(jià)值。