膽道系統(tǒng)惡性腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展及展望①

甄自力 沈哲民 孫培龍

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院普外科，上海201508）

膽道系統(tǒng)惡性腫瘤（biliary tract cancers，BTC）是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，可發(fā)生于肝內(nèi)膽管、肝外膽管等不同部位，主要包括肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）。其中，ICC 是僅次于肝細(xì)胞性肝癌的第二大原發(fā)性肝癌，發(fā)病率約占原發(fā)性肝癌的10%～15%，近年來發(fā)病率不斷上升，ICC起病隱匿，發(fā)病時已處于晚期，因此其惡性程度及死亡率較高，但由于近年醫(yī)療水平的提高，對ICC的治療效果有了一定的改善［1-2］。治愈BTC 的主要治療方式是完全切除腫瘤或進(jìn)行肝移植，但即使采取這些積極干預(yù)的方法復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%［3］。同時，絕大多數(shù)BTC 患者在明確診斷時已進(jìn)入晚期階段而無法進(jìn)行手術(shù)干預(yù)，未經(jīng)治療的中位生存期為3～6 個月，五年生存率為5%～10%［4］。在現(xiàn)行的診療標(biāo)準(zhǔn)下，這些晚期患者在接受最佳治療方案后中位生存期仍小于1年［5］。因此，探尋能夠針對BTC 有效的新的治療方法至關(guān)重要。

近年來，惡性腫瘤免疫治療是腫瘤治療領(lǐng)域的一個重大突破，并且已被證明可通過誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞，達(dá)到有效治療耐藥性實(shí)體惡性腫瘤（如非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤等）的效果［6］。作為炎癥相關(guān)性腫瘤，BTC 的免疫抑制微環(huán)境能夠通過多種機(jī)制促進(jìn)免疫耐受和免疫逃避，但許多研究表明免疫治療仍存在成功治療的機(jī)會［7］。因此，誘發(fā)更加強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答是針對BTC 的一種有效的治療策略。本綜述將回顧免疫檢查點(diǎn)阻斷、腫瘤疫苗和過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移等BTC免疫學(xué)治療的最新進(jìn)展，并討論BTC 免疫療法的潛在進(jìn)展及挑戰(zhàn)。

1 惡性腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)

正常人體的免疫反應(yīng)可以保護(hù)機(jī)體免受腫瘤或外來病原體的侵害，同時維持自身適度的免疫耐受防止發(fā)生自身免疫性疾病，其中，免疫反應(yīng)包括固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。先天性免疫反應(yīng)在病原體侵入機(jī)體后數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)迅速發(fā)生防御反應(yīng)，主要效應(yīng)細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK cell）、粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等。特異性適應(yīng)性免疫應(yīng)答主要是通過樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）提呈抗原，從而刺激T 細(xì)胞成熟并募集其對腫瘤細(xì)胞或外來病原體進(jìn)行靶向破壞，同時形成免疫記憶（圖1）。

圖1 固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)Fig.1 Innate immune response and adaptive immune response

在某些惡性腫瘤發(fā)生過程中，免疫系統(tǒng)可識別出其由于基因表達(dá)異常所產(chǎn)生的腫瘤抗原，在早期將腫瘤細(xì)胞清除從而抑制疾病發(fā)展。然而，具有免疫抑制或免疫逃逸特性的BTC 等惡性腫瘤可通過積累免疫抑制細(xì)胞群、呈遞有缺陷的抗原、激活抑制性受體-配體通路等機(jī)制促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展［8］。此外，BTC 及其周圍的細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞等構(gòu)成一個具有復(fù)雜功能網(wǎng)絡(luò)的免疫微環(huán)境，通過分泌細(xì)胞因子或信號傳導(dǎo)抑制該部位免疫反應(yīng)，從而達(dá)到驅(qū)動免疫逃逸的作用［9］。

2 免疫檢查點(diǎn)阻斷

免疫檢查點(diǎn)是一類細(xì)胞膜表面的特定受體，細(xì)胞間受體相互作用可抑制免疫反應(yīng)，而阻斷免疫檢查點(diǎn)能夠使免疫細(xì)胞得到激活，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，可作為惡性腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)。其中，程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）及其配體（programmed cell death ligand-1，PD-L1）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）和T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin，TIM-3）等免疫檢查點(diǎn)在BTC 免疫治療中發(fā)揮重要作用（圖2）。

圖2 免疫檢查點(diǎn)阻斷作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of immune checkpoint blockade

2.1 PD-1/PD-L1 PD-1 是一種表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK 細(xì)胞上的一種免疫球蛋白超家族抑制分子，在維持免疫耐受和抑制T細(xì)胞的細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用，PD-1與PD-L1結(jié)合可抑制T 細(xì)胞的活化并導(dǎo)致其凋亡，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用［10］。此外，PD-L1 不僅可以在CCA 腫瘤細(xì)胞表達(dá)，還出現(xiàn)在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）細(xì)胞膜表面，腫瘤細(xì)胞與TAM 上的PD-L1 同時與CD8+T 細(xì)胞上的PD-1 結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)了CD8+T 細(xì)胞凋亡和免疫逃逸反應(yīng)，為腫瘤的進(jìn)一步生長鋪平了道路［11］。BTC 患者體內(nèi)PD-1+CD8+T 細(xì)胞表達(dá)量增加不僅預(yù)示著腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵略性，也表明患者生存率較低、預(yù)后較差。

對ICC 組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1 可在腫瘤細(xì)胞和炎癥細(xì)胞聚集物中表達(dá)。此外，PD-1/PD-L1上調(diào)的腫瘤通常與預(yù)后較差的不良事件發(fā)生相關(guān)，表明這些腫瘤可能是成為檢查點(diǎn)阻斷劑進(jìn)行治療的靶點(diǎn)。有研究表明，在ICC 切除樣本中有72% 的腫瘤細(xì)胞樣本表達(dá)PD-L1，與PD-L1 陰性相比較，陽性患者的總生存時間明顯降低。盡管單獨(dú)的PD-1 或PD-L1 表達(dá)與臨床結(jié)局無關(guān)，但與PD-L1高表達(dá)或HLA Ⅰ類抗原低表達(dá)的患者相比，低表達(dá)的PD-L1 和高表達(dá)HLA Ⅰ類抗原的患者總生存時間更長［12］。這些研究為研究BTC 的PD-1/PD-L1 表達(dá)對預(yù)后的影響提供了理論依據(jù)，也為將來評估BTC的檢查點(diǎn)抑制療法的實(shí)用性奠定了基礎(chǔ)。

在臨床方面，一項(xiàng)針對BTC 晚期患者應(yīng)用PD-L1 抑制劑治療的臨床研究表明，檢查點(diǎn)抑制劑治療耐受性良好，具有較好的抗腫瘤活性，總體緩解率為17.4%［13］。此外，BTC 中一部分人群是由于錯配修復(fù)缺陷而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而作為PD-1抑制劑的派姆單抗（Pembrolizumab）能夠?qū)﹀e配修復(fù)缺陷腫瘤有持久的反應(yīng)，這為錯配修復(fù)缺陷致BTC 提供了新的治療思路［14］。目前，多項(xiàng)Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在評估聯(lián)合檢查點(diǎn)抑制劑療法對晚期BTC 的影響，在很大程度上有助提高BTC的治療效果。

2.2 CTLA-4 CTLA-4是一種表達(dá)在活化T細(xì)胞上的抑制受體，主要存在于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其競爭性結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）上CD28 的配體CD80 和CD86。CTLA-4 抑制劑使得其無法競爭性抑制APC 和T 細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致免疫反應(yīng)可以正常進(jìn)行。CTLA-4 被證明在多種腫瘤中具有抑制腫瘤相關(guān)性抗原（tumor associated antigen，TAA）的識別和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的增殖的效應(yīng)［15］。

有研究表明，CCA 患者體內(nèi)CLTA-4 表達(dá)水平與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，低表達(dá)CLTA-4與總生存時間延長以及無瘤生存密切相關(guān)［16］。這證明了CTLA-4 的表達(dá)對BTC 患者預(yù)后具有顯著影響。

靶向CTLA-4 的抗體的許多臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。CTLA-4 抗體替西木單抗（Tremelimumab）應(yīng)用于CCA 患者的臨床試驗(yàn)表明其抗腫瘤效果明顯，同時未發(fā)生免疫相關(guān)的不良事件，接受CTLA-4 抗體治療患者的中位生存時間和總生存時間均高于未接受者，同時6 周后活檢發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤C(jī)D8+T 細(xì)胞明顯增加，提示該方法有持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

3.3 LAG-3和TIM-3 LAG-3是免疫球蛋白超家族蛋白中的成員，通常能夠與Ⅱ類MHC分子高親和力結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的共刺激作用［17］。臨床上，正在Ⅰ期試驗(yàn)（NCT01968109）中測試抗PD-1 聯(lián)合LAG-3對免疫檢查點(diǎn)的雙重阻斷。

TIM-3 是一種表達(dá)在分泌IFN-γ 的輔助性T 細(xì)胞，NK 細(xì)胞和CTL 上的跨膜蛋白可與可溶性配體galectin-9 相互作用，從而負(fù)性調(diào)控T 細(xì)胞反應(yīng)抑制腫瘤免疫應(yīng)答［18］。在慢性HBV 感染患者體內(nèi)T 細(xì)胞浸潤伴隨TIM-3 表達(dá)增加，且TIM-3/galectin-9 途徑表面的存在HBV相關(guān)BTC患者預(yù)后較差［19］。

3 腫瘤疫苗

隨著越來越多的TAA 得到明確，針對腫瘤的疫苗也得到廣泛關(guān)注與研究。通過使用全細(xì)胞疫苗、抗原特異性肽疫苗或搭載抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗，機(jī)體免疫系統(tǒng)識別腫瘤特異性抗原并對其敏感性升高，使得機(jī)體可以快速產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答以識別和消除腫瘤細(xì)胞。

在BTC 相關(guān)性抗原中，Wilm 腫瘤蛋白1（Wilm's tumor protein 1，WT1）和黏蛋白1（mucin protein 1，MUC1）受到了密切關(guān)注［20］。多種惡性腫瘤中可以檢測到WT1 和MUC1 突變，該突變與預(yù)后不良和藥物耐受性密切相關(guān)。研究表明，80%BTC 患者體內(nèi)出現(xiàn)WT1 突變，90%BTC 患者體內(nèi)MUC1 過表達(dá)，并認(rèn)為與中位生存期縮短顯著相關(guān)［21-22］。

一項(xiàng)藥物臨床研究中，8 名BTC 患者應(yīng)用WT1肽疫苗聯(lián)合吉西他濱（Gemcitabine）治療，這8 例患者耐受良好且未出現(xiàn)劑量毒性反應(yīng)。疫苗接種后，觀察到50% 的BTC 患者出現(xiàn)2 個月的病情穩(wěn)定期，且總生存時間達(dá)到288 d，65% 患者體內(nèi)可檢測到WT1特異性T細(xì)胞［23］。另一項(xiàng)藥物臨床研究中，8例BTC 患者應(yīng)用MUC1 肽疫苗治療，由抗MUC1 抗體介導(dǎo)了特異性腫瘤免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示患者均耐受良好，但其中7例患者病情仍處于進(jìn)展期［24］。此外，有研究表明，應(yīng)用5-氟尿嘧啶、Gemcitabine 或IFN-γ治療可增加ICC 細(xì)胞中WT1 和MUC1 抗原的表達(dá)，該結(jié)果為腫瘤免疫的聯(lián)合療法提供了依據(jù)［25］。

除了針對WT1 和MCU1 抗原的腫瘤免疫疫苗研究，多個肽抗原聯(lián)合的疫苗也逐漸在BTC 中受到關(guān)注。對9例無法手術(shù)的晚期BTC 患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞抗原6 復(fù)雜基因位點(diǎn)K、TTK 蛋白激酶、胰島素樣生長因子ⅡmRNA結(jié)合蛋白3和含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)1 的四肽疫苗治療，其中78% 的患者觀察到特異性T 細(xì)胞應(yīng)答，除了在接種部位皮膚出現(xiàn)二型超敏反應(yīng)外，無進(jìn)展生存期和中位生存時間也顯著延長［26］。此外，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白1、鈣黏蛋白3和驅(qū)動蛋白家族成員20A 三肽聯(lián)合的腫瘤疫苗免疫治療，參與治療的9 例患者均出現(xiàn)特異性T 細(xì)胞應(yīng)答，5 例患者疾病出現(xiàn)穩(wěn)定期，但總生存時間僅9.7個月［27］。雖然接受腫瘤疫苗治療的患者中位生存期無根本性的改變，但特異性T 細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)預(yù)示著腫瘤疫苗的有效性。

應(yīng)用搭載抗原的樹突細(xì)胞疫苗同樣可以激活、上調(diào)T 細(xì)胞反應(yīng)（圖3）。DC 作為最重要的APC，在激活幼稚T細(xì)胞和調(diào)節(jié)初次免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。將WT1和MUC1 抗原搭載于樹狀細(xì)胞疫苗用于治療65 例無法手術(shù)或復(fù)發(fā)的BTC 患者，其中發(fā)熱患者的總生存時間明顯改善，提示免疫應(yīng)答有益于患者預(yù)后［28］。

圖3 搭載抗原的樹突細(xì)胞抗腫瘤疫苗作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of anti-tumor vaccine of dendritic cells carrying antigen

4 過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移

過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移免疫治療即通過輸注患者自身的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞增加腫瘤特異性免疫反應(yīng)和腫瘤內(nèi)T細(xì)胞浸潤。與腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，過繼T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加了腫瘤微環(huán)境中活化的CTL細(xì)胞的數(shù)量，從而形成更強(qiáng)的腫瘤免疫應(yīng)答。

許多案例證明了過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療對BTC的有效性。有病例報(bào)道了1例CCA廣泛轉(zhuǎn)移的患者在進(jìn)行自身特異性反應(yīng)性T細(xì)胞擴(kuò)增并轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)長達(dá)7 個月的無瘤生存［29］。表明過繼T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療的可行性，作為ICC術(shù)后的輔助治療方法，36例患者納入了前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)行活化的T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時應(yīng)用搭載抗原的樹突細(xì)胞疫苗，接受輔助免疫治療的患者中位生存時間達(dá)到18.3個月，總生存時間31.9個月，而未接受者中位生存時間位7.7個月，總生存時間為17.4 個月［30］。表明應(yīng)用過繼T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療明顯有益于BTC 患者預(yù)后并能夠顯著延長生存期。

5 結(jié)語及展望

BTC作為膽道系統(tǒng)腫瘤，起病隱匿，發(fā)病時往往已經(jīng)到達(dá)晚期，現(xiàn)有的干預(yù)手段無法滿足對預(yù)后的基本要求，迫切需要研究新的有效干預(yù)手段以提升患者總生存時間。腫瘤免疫治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的一個重大突破，能夠通過誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞達(dá)到有效治療的效果。因此，應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)阻斷、腫瘤疫苗和過繼性T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方法可以促進(jìn)腫瘤免疫反應(yīng)，對BTC 進(jìn)行積極干預(yù)，并有效改善患者預(yù)后。

雖然目前針對BTC 免疫療法的研究甚少，但仍有證據(jù)表明這種方法將成為未來醫(yī)生應(yīng)對BTC 的有力工具。進(jìn)一步研究證明其具有顯著的臨床功效以及優(yōu)化治療方案是當(dāng)務(wù)之急，同時也應(yīng)該聚焦于尋找新的靶點(diǎn)以及聯(lián)合療法。對于所有晚期BTC患者應(yīng)用同一種免疫療法的可行性極低，應(yīng)根據(jù)不同患者選擇特定的靶向治療，比如，對于某一亞群患者使用效力較高的某種方法，抑或是在多肽聯(lián)合疫苗使用中做到精準(zhǔn)靶向治療。同時，探尋更多的TAA 將有利于為后續(xù)個體化治療提供更加詳盡而準(zhǔn)確的指導(dǎo)。