腫瘤環(huán)境下腺苷受體通路的免疫功能及臨床意義①

胡英豪 左 堅 陶夢情 羅佳佳 王 秀

（皖南醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，蕪湖241000）

腺苷是一種廣泛分布的內(nèi)源性核苷，主要由細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（triphosadenine，ATP）降解而成。當(dāng)機體組織處于缺血、缺氧、炎癥、創(chuàng)傷等狀態(tài)時，胞外腺苷迅速升高，以保護組織免受過度炎癥損傷，并促進組織損傷后修復(fù)［1］。由于腫瘤患者體內(nèi)長期存在缺氧與慢性炎癥的微環(huán)境，胞外腺苷穩(wěn)定處于高水平狀態(tài)，這一現(xiàn)象導(dǎo)致相應(yīng)的G 蛋白偶聯(lián)受體持續(xù)過度激活，從而表現(xiàn)出免疫耐受的基本特征，進而直接促進了腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移［2］?；谏鲜霈F(xiàn)象，現(xiàn)代學(xué)者進行了大量的相關(guān)研究。本文就相關(guān)研究的進展及臨床意義進行總結(jié)，以啟發(fā)開展后續(xù)的機制研究與臨床應(yīng)用。

1 腺苷的代謝

在正常組織中，腺苷因其快速的分解代謝及利用環(huán)路，保持低濃度水平。腺苷的生成途徑有：①ATP 通過CD39 轉(zhuǎn)化為單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP），AMP 在CD73 的去磷酸化作用下生成腺苷；②S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH）在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl homocysteine hydrolase，SAHH）的作用下可逆性生成腺苷；③在某些癌癥中，由補救途徑釋放的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）通過CD38-CD203a-CD73途徑水解為腺苷［3-4］。腺苷的降解及利用途徑有：①在腺苷酸激酶（adenosine kinase，AK）的作用下磷酸化為AMP；②在腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）的作用下不可逆地轉(zhuǎn)化為肌苷［5］。見圖1。

圖1 腺苷代謝途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram of adenosine metabolic pathways

2 腫瘤中腺苷升高的原因

缺氧、炎癥等腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)CD39 和CD73 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高，導(dǎo)致相關(guān)蛋白過表達(dá)。CD39和CD73 作為細(xì)胞表面的核苷酶，CD39 催化ATP/ADP 水解，獲得降解產(chǎn)物AMP，CD73 進一步催化AMP降解為腺苷［6］。高表達(dá)的CD39和CD73直接導(dǎo)致腺苷在細(xì)胞外大量蓄積。另一方面，CD38 作為ADP 核糖基環(huán)化酶，腫瘤中高水平的NAD+被CD38環(huán)化為環(huán)腺苷二磷酸核糖，并水解成ADP 核糖，胞外酶CD203a 以ADP 核糖為底物，產(chǎn)出AMP，最終通過CD73降解為腺苷［7］。與此同時，缺氧環(huán)境抑制了AK 的表達(dá)，通過降低由其主導(dǎo)的磷酸化作用，抑制了腺苷向AMP 轉(zhuǎn)變的途徑［8］；而ADA 活性被過量腺苷抑制，無法將腺苷快速降解成肌苷［4］。上述諸多因素共同決定了腫瘤環(huán)境下胞外腺苷水平持續(xù)偏高。

3 腫瘤條件下腺苷誘發(fā)免疫抑制的基本機制

腺苷復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過與相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體［腺苷受體（adenosine receptor，AR）］的結(jié)合介導(dǎo)，后者包括A1、A2A、A2B、A3型（分別縮寫為A1R、A2AR、A2BR、A3R）若干亞型［9］。基礎(chǔ)濃度下，腺苷優(yōu)先激動A1R、A2AR、A3R，而在高濃度條件下，激活A(yù)2BR［10］。由于ATP 在腫瘤內(nèi)被迅速降解為腺苷，這一方面導(dǎo)致ATP依賴性P2嘌呤能受體介導(dǎo)的抗腫瘤作用被抑制［3，11］。更為重要的是，蓄積的腺苷有利于A2AR 和A2BR 的表達(dá)與激動［12］。鑒于A2AR和A2BR 在各種免疫細(xì)胞亞群上均有分布，這一現(xiàn)象是腺苷誘發(fā)廣泛的免疫抑制作用的重要基礎(chǔ)［3］。以下根據(jù)腫瘤免疫特征，選擇與之關(guān)聯(lián)最為密切的細(xì)胞類型，分述過量胞外腺苷誘發(fā)腫瘤免疫無能的具體途徑。見圖2。

圖2 腫瘤條件下腺苷誘發(fā)的免疫抑制Fig.2 Adenosine-induced immunosuppression in tumor environments

3.1 T 淋巴細(xì)胞 T 細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫。Th1和CTL等效應(yīng)T細(xì)胞亞群的細(xì)胞毒作用及防御性免疫功能是機體應(yīng)對腫瘤威脅的重要方式。A2AR 和A2BR 的過度激動會促進細(xì)胞內(nèi)cAMP 生成，這一現(xiàn)象增強了蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活性，后者進一步抑制T 細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）及IL-2 受體觸發(fā)的信號傳導(dǎo)，下調(diào)效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖與活化［13-16］。此外，腺苷通過興奮A2AR 可干預(yù)淋巴細(xì)胞激活的關(guān)鍵性分子事件發(fā)生，并通過抑制TCR 信號傳導(dǎo)，抑制IL-2 的產(chǎn)生及CD25 和CD69 的表達(dá)，同時也使Fas/FasL 的表達(dá)減少，阻礙T 細(xì)胞的正?；罨懊庖吖δ艿陌l(fā)揮［17-18］。值得重視的是，IL-2 對活化T 細(xì)胞增殖至關(guān)重要。腺苷通過激活A(yù)2AR 和A2BR，抑制STAT5 磷酸化，下調(diào)IL-2 合成，使得癌癥患者中T 淋巴細(xì)胞克隆數(shù)量減少，細(xì)胞免疫應(yīng)答不足［17］。

相對于對效應(yīng)T 細(xì)胞的抑制作用，腺苷對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）表現(xiàn)出明顯的上調(diào)作用。該型細(xì)胞具有免疫應(yīng)答能力低下和免疫抑制兩大特征，一般情況下通過抑制效應(yīng)T 細(xì)胞活性發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)功能，從而避免防御性免疫過度及炎癥的惡性發(fā)展。有證據(jù)表明，腺苷信號可通過A2AR 途徑增強Treg 的免疫抑制功能，同時促進CTLA-4 和PD-1 表達(dá)［19-20］。CTLA-4 向效應(yīng)T 細(xì)胞傳遞抑制信號，而PD-1 促進程序性死亡，進一步抑制其活化和增殖，使腫瘤細(xì)胞獲得逃避免疫。在此過程中，腺苷還可通過激活A(yù)2AR 或cAMP/PKA 通路，降低T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并誘導(dǎo)FoxP3 表達(dá)，促進T細(xì)胞向Treg方向分化［21］。

對記憶性T 細(xì)胞而言，腺苷與A2AR 信號可調(diào)節(jié)IL-7Rα 和IL-15Rα 表達(dá)［22-23］；而IL-7 與IL-15 與其相應(yīng)的受體IL-7Rα、IL-15Rα 結(jié)合，在記憶性T 細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞克隆的長期維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory T cell，Tem）相比，中央記憶T 細(xì)胞（central memory T cell，Tcm）對腺苷的敏感度更高。腺苷對CD8+T細(xì)胞的免疫抑制主要作用于CD8+Tcm，通過激活A(yù)2AR/PKA，阻礙CD8+T 細(xì)胞TCR/mTORC1 的信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致隨后的代謝和效應(yīng)功能損害，使外周淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的免疫能力受損［24］。

3.2 自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞 NK細(xì)胞無需抗原預(yù)先致敏就能破壞靶細(xì)胞，且其殺傷無MHC限制性，應(yīng)答速度快，是腫瘤免疫中的關(guān)鍵角色之一。A2AR 的激活可抑制NK 細(xì)胞的激活、成熟和細(xì)胞溶解潛力［3］。究其原因，腺苷對A2AR 的激動減少了穿孔素的表達(dá)，并減少大量促炎細(xì)胞因子的生成，如IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-GSF和MIP-1α等［12，25］。而上述物質(zhì)對于NK 細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用至關(guān)重要。此外，在此過程中NK 細(xì)胞依賴FASL 途徑產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞裂解能力也大幅下降［26］。

3.3 巨噬細(xì)胞 一般認(rèn)為巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，在不同環(huán)境因素刺激下可分化為M1 和M2 兩種不同的極化類型。一般而言，M1型巨噬細(xì)胞可高效殺傷腫瘤細(xì)胞，而M2 型則促進腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移。在腫瘤微環(huán)境中，腺苷激動A1R、A2AR、A3R可抑制巨噬細(xì)胞在TLR4激動條件下釋放IL-12、TNF-α、MIP-1α、NO 和超氧化物等促炎因子，從而弱化巨噬細(xì)胞的吞噬及抗原遞呈功能［12-13］。而A2AR 和A2BR 的激動又有效地誘導(dǎo)了Arg-1、IL-10 和VEGF 的合成，從而促進巨噬細(xì)胞的M2 型極化［4，12］。上述現(xiàn)象導(dǎo)致腫瘤條件下巨噬細(xì)胞的促炎及防御性免疫活性低下，更多地呈現(xiàn)出了M2 型的表型和功能特征，異常分泌VEGF等生長因子，促進了腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移。

3.4 樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC） DC是功能最強的專職抗原提呈細(xì)胞，為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要啟動者。腺苷對A2AR和A2BR的觸發(fā)降低了DC啟動Th1 免疫應(yīng)答的能力，并促使幼稚T 細(xì)胞向Th2 和Th17 分化［12］。相對于包括A2AR 在內(nèi)的其他腺苷受體，A2BR 對DC 功能的影響最為顯著［25］。腺苷通過激動該受體，可誘使DC 高表達(dá)IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、IDO、TGF-β、Arg-2 和COX-2，低表達(dá)IL-12 和IFN-γ［3，11，27］。上述表達(dá)譜的改變導(dǎo)致DC 發(fā)育及功能異常，降低了DC 對腫瘤抗原交叉遞呈的能力［25］。這部分解釋了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機制。

3.5 骨髓來源的抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC） MDSC 是處于不同分化階段的骨髓祖細(xì)胞和前體細(xì)胞組成的異質(zhì)性群體［28］。因其具有免疫抑制、促血管新生等特性，而對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有推動作用［29］。腫瘤組織內(nèi)高濃度的腺苷作用于A2BR，促進了MDSC 群體的擴增［25］。也有文獻(xiàn)報道，A2AR 的激活促進了MDSC 產(chǎn)生IL-10，而IL-10 作為炎癥和免疫抑制因子，其過表達(dá)與腫瘤的增殖密切相關(guān)［12］。

4 腺苷信號軸與腫瘤治療

4.1 逆轉(zhuǎn)腫瘤缺氧微環(huán)境 在腫瘤微環(huán)境下，缺氧環(huán)境激活的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HIF-1α 會強有力地誘導(dǎo)CD39、CD73表達(dá)，從而通過催化途徑增加胞外腺苷的產(chǎn)生［4］。另一方面，缺氧下調(diào)AK，抑制腺苷的降解轉(zhuǎn)化。有報道表明，通過暴露于高氧大氣（60%氧）逆轉(zhuǎn)缺氧，可有效地降低腫瘤內(nèi)TGF-β、CTLA-4、COX-2和FoxP3表達(dá)，表現(xiàn)出有利于腫瘤免疫的微環(huán)境改變；與此同時，CD39、CD73、A2AR 和A2BR 的表達(dá)水平也大幅降低［20-30］。上述證據(jù)表明，緩解腫瘤組織內(nèi)局部缺氧環(huán)境是抑制腺苷途徑異常上調(diào)，逆轉(zhuǎn)免疫無能，治療腫瘤的可行途徑。

4.2 阻斷CD38、CD39、CD73 功能 作為操縱腺苷水平的主要分子，CD39、CD73 在癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中均廣泛表達(dá)。CD73 敲除的小鼠表現(xiàn)出腫瘤的生長和擴散轉(zhuǎn)移受阻［31］。而采用單克隆抗體或選擇性抑制劑阻斷CD73 信號也可產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性［32］。除瘤體減小以外，還可以觀察到顯著的腫瘤血管新生抑制及多藥耐藥性降低［33-34］。與此類似，CD39 缺失的小鼠也表現(xiàn)出腫瘤的生長及新生血管生成受限［35-36］。不同的是，CD39 抑制除下調(diào)腺苷途徑以外，還可觸發(fā)eATP-P2X7-炎癥體-IL-18軸，減少腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增強腫瘤內(nèi)T 細(xì)胞效應(yīng)功能，克服抗PD-1耐藥性［37］。

由于NAD+通過CD38-CD203a-CD73 途徑生成腺苷，CD38 也是潛在的抗腫瘤靶點［38］。CD38 敲除與CD38 單克隆抗體治療均表現(xiàn)出很好的抗腫瘤效果［39-40］。由于NAMPT 是NAD+合成的限速酶，理論上抑制NAMPT/NAD+合成途徑，也有利于降低腺苷水平?，F(xiàn)有證據(jù)也已證明，該通路是極具希望的新型腫瘤治療靶點［41］。但考慮到NAMPT 兼具的代謝及免疫調(diào)控功能，上述治療方案涉及的具體機制復(fù)雜，而腺苷通路調(diào)控可能僅部分涉及其中。

4.3 調(diào)控腺苷受體 鑒于腺苷受體對腺苷通路的核心作用，特異性抑制必將對該通路介導(dǎo)的免疫功能及腫瘤結(jié)局產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響［42］。除了上述重點論述的免疫調(diào)控機制以外，該受體通路很多時候還可直接作用于腫瘤細(xì)胞，通過多種途徑影響臨床結(jié)局。

A1R 與多種腫瘤密切相關(guān)，如膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌等［43-44］。研究發(fā)現(xiàn)，A1R 拮抗劑DPCPX 通過下調(diào)ERK/JNK 的磷酸化抑制了腎細(xì)胞癌的增殖和遷移［45］；同時可誘導(dǎo)P53表達(dá)，從而促進乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡［46］。但是，一項研究發(fā)現(xiàn)A1R 激動劑CHA 及R-PIA 對HepG2、CACO2 細(xì)胞的增殖有抑制作用，而在成纖維細(xì)胞卻沒有這種影響，表現(xiàn)出良好的特異性抗腫瘤效果［47］。上述看似矛盾的結(jié)論表明A1R通路的具體功能存在顯著的組織/細(xì)胞特異性，其確切的臨床意義仍有待進一步研究。

A2AR 拮抗劑主要通過上調(diào)免疫細(xì)胞功能增強體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)，實現(xiàn)腫瘤的治療。A2AR 拮抗劑Ciforadenant 通過阻斷低氧-A2A-腺苷信號軸消除腫瘤微環(huán)境對T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能抑制，這對腎癌的患者的臨床治療、預(yù)后改善及提高生存率起到積極作用［48］。有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合抑制CD73 和A2AR腺苷信號將進一步提高抗腫瘤的免疫應(yīng)答［49］。此外，阻斷A2AR 能抑制癌癥病理性淋巴管生成，阻斷腫瘤細(xì)胞通過淋巴系統(tǒng)擴散［50］。

A2BR 在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫抑制作用中發(fā)揮重要作用［51］。研究發(fā)現(xiàn)，A2BR 的激活在體外促進了4T1.2 腫瘤細(xì)胞的趨化性，加速腫瘤體內(nèi)的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［52］。與此對應(yīng)，敲除、阻斷或拮抗A2BR 抑制了癌細(xì)胞的侵襲力，抑制腫瘤的生長遷移［53-56］。體內(nèi)研究表明，免疫調(diào)節(jié)是A2BR 影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制途徑。激動A2BR 將促進黑色素瘤小鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長，阻斷A2BR 則降低了腫瘤中的MDSC 浸潤并恢復(fù)T 細(xì)胞抗腫瘤的免疫能力［57］。

腫瘤中A3R 是一個矛盾的集合體，其對腫瘤的確切影響仍有待闡明。大量文獻(xiàn)報道其在癌細(xì)胞和實體瘤中高表達(dá)，且激活A(yù)3R 可增強膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遷移與侵襲能力［58-59］。這表明阻斷A3R 可能是抗腫瘤的有效策略。然而，A3R 的激動卻也表現(xiàn)出顯著的抗增殖與促凋亡效果，這一結(jié)論在乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、黑色素瘤等腫瘤中都得到了證實［60-63］。同時，A3R 激動劑Cl-IB-MECA 與CF102 通過抑制PKA、Erk 和AKT 等癌細(xì)胞增殖信號通路，在體外可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［64］。此外，A3R 的激動增強了NK 細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞的能力，也抑制了腫瘤內(nèi)PI3K/AKT 信號通路及其下游NF-κB 通路的激活，表現(xiàn)出抗炎與抗癌效果［65-66］。

4.4 腺苷靶向治療聯(lián)合其他抗癌療法 與單獨阻斷腺苷途徑相比，聯(lián)合其他治療方案能有效地提高抗癌效果。CD73 的靶向阻斷可增強抗PD-1 和抗CTLA-4 單克隆抗體的抗腫瘤活性［67］；CD73-腺苷軸阻斷結(jié)合放射治療表現(xiàn)出CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞及IFN-γ 增加，抗結(jié)腸癌的增殖轉(zhuǎn)移能力增強［68］。相似地，抑制CD38 能提高PD-L1 的抗腫瘤功效：與單獨的PD-L1 靶向治療相比，接受聯(lián)合治療的荷瘤小鼠體內(nèi)顯示出更高水平的CD8+T 細(xì)胞、ICOS+、CD4+T 細(xì)胞，以及更低水平的MDSC 和Treg［69］。同樣，腺苷A2BR 的阻斷亦能增強索拉非尼的抗肝癌效果［70］。

4.5 靶向治療的安全性 大量文獻(xiàn)報道了腺苷信號通路的靶向治療在腫瘤上所表現(xiàn)出的積極效果，但目前對其所產(chǎn)生的不良反應(yīng)與對肝、腎的副作用知之甚少。目前臨床試驗中，已知MEDI9447（CD73的單抗之一）最常見的不良反應(yīng)是腹瀉（8.7%）、發(fā)熱（8.7%）、疲勞（6.5%）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）升高（6.5%）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高（6.5%）、堿性磷酸酶（ALP）升高（6.5%）［71］。其他CD39、CD73 的單克隆抗體，A2AR、A2BR 的小分子拮抗劑與A3R 的激動劑處于志愿患者招募階段、Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗階段，披露的也多是提高了抗腫瘤的效果，尚無公開的數(shù)據(jù)可以評估單藥治療或聯(lián)合治療的安全性。隨著臨床試驗的進展，預(yù)計靶向治療的安全性及耐受性的報道將會越來越多。

5 總結(jié)

腺苷介導(dǎo)的免疫抑制作用是保護組織免受過度炎癥損傷及促進組織損傷后修復(fù)。但在腫瘤中，這一過程卻被劫持，通過減弱T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和DC的免疫功能，增強Treg和MDSC的免疫抑制能力，以及促使巨噬細(xì)胞向M2 極化等方式，嚴(yán)重削弱了免疫系統(tǒng)的抗腫瘤功能。與此同時，腺苷誘發(fā)的A2AR與A2BR 過度激活促進了腫瘤中的血管新生，如：A2AR 刺激的巨噬細(xì)胞及A2BR 刺激的MDSC、DC 都會促使VEGF分泌增加等［72-73］。從這些角度而言，腫瘤組織內(nèi)的腺苷蓄積是重要的繼發(fā)性病理因素。通過對CD39-CD73-腺苷-腺苷受體途徑的抗癌研究發(fā)現(xiàn)，降低腫瘤內(nèi)腺苷的含量能使腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移能力降低，而且還可促進腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到很好的抗腫瘤效果。靶向腺苷通路的抗癌療法既拓寬了治療腫瘤的途徑，還對今后聯(lián)合放化療、手術(shù)治療、中醫(yī)藥治療、分子靶向治療等其他抗癌療法的定向開發(fā)起到積極作用，是極具前景的腫瘤免疫治療的新靶點。