CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的脫靶效應(yīng)及優(yōu)化方略①

彭燦燦 王惠明

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢430060）

2017年以來(lái)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局接連批準(zhǔn)諾華公司的嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）細(xì)胞產(chǎn)品CTL019 和Kite 制藥的Yescarta（KTEC19）上市，CAR-T 療法開(kāi)始出現(xiàn)在大眾視野，并逐漸成為最具前景的腫瘤治療方式之一。近年CART在血液系統(tǒng)腫瘤治療，尤其是靶向CD19 CAR-T在急性難治型淋巴細(xì)胞白血病治療中，取得了矚目成就［1］。但CAR-T 在實(shí)體腫瘤方面卻鮮有實(shí)質(zhì)進(jìn)展，可能與脫靶效應(yīng)、歸巢及T 細(xì)胞耗竭等有關(guān)。本文結(jié)合近年實(shí)體瘤相關(guān)研究，就CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤脫靶效應(yīng)進(jìn)行綜述，并提出優(yōu)化方略。

1 脫靶效應(yīng)概念及產(chǎn)生原因

腫瘤抗原根據(jù)其特異性可分為：腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen，TSA）和腫瘤相關(guān)性抗原（tumor-associated antigen，TAA）。腫瘤表面腫瘤特異性抗原較為缺乏，CAR-T 靶向的多為腫瘤相關(guān)性抗原，因此，CAR-T 在識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)，損傷低表達(dá)靶抗原的正常組織，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，嚴(yán)重可危及患者生命。2010年，MORGAN 等［2］設(shè)計(jì)靶向ERBB2 CAR-T 治療結(jié)腸癌患者，患者于輸注CAR-T 5 d后出現(xiàn)進(jìn)行性低血壓和心動(dòng)過(guò)緩，隨后死于心臟驟停，為CAR-T識(shí)別并攻擊低表達(dá)ERBB2的肺上皮細(xì)胞所致。因此，脫靶效應(yīng)在CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤中備受關(guān)注。

2 克服CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤脫靶效應(yīng)的研究進(jìn)展

2.1 尋找合適的腫瘤相關(guān)性抗原 目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原較少，EGFRvⅢ（EGFR 受體突變體）作為少有的腫瘤特異性抗原，可被CAR 精準(zhǔn)識(shí)別，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中顯示出較好療效［3］。而腫瘤相關(guān)性抗原則較多，間皮素（mesothelin，MSLN）可用于惡性間皮瘤、胰腺癌等治療，神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）可用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤等治療，人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）可用于乳腺癌治療等，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）可用于胃腸道腫瘤和部分腺癌治療，前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）可用于前列腺癌治療等。實(shí)體腫瘤具有高度異質(zhì)性，即使在同一腫瘤病灶內(nèi)，單一腫瘤相關(guān)性抗原也無(wú)法覆蓋所有腫瘤細(xì)胞，另外腫瘤相關(guān)性抗原在正常組織表達(dá)引起CAR 識(shí)別殺傷可能導(dǎo)致災(zāi)難性脫靶毒性，因此，選擇合適的腫瘤相關(guān)性抗原至關(guān)重要［4］。理想的腫瘤相關(guān)性抗原應(yīng)100% 表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)保證在正常組織上不表達(dá)或低表達(dá)，若低表達(dá)于心臟、肝臟、肺臟等重要器官可能引發(fā)嚴(yán)重后果［5-6］。尋找合適的腫瘤相關(guān)性抗原需要在CAR 殺傷腫瘤細(xì)胞效力和對(duì)低表達(dá)靶抗原的正常組織導(dǎo)致脫靶毒性間獲得最好的平衡，力求對(duì)重要臟器損傷達(dá)到最小且不影響靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

2.2 靶向腫瘤特異性糖基化位點(diǎn) CAR-T 多數(shù)靶向腫瘤相關(guān)性抗原，腫瘤細(xì)胞和正常組織均有表達(dá)，不可避免出現(xiàn)脫靶毒性，除少有的特異性抗原EGFRvⅢ（EGFR 受體突變體）外，腫瘤特異性的糖基化靶點(diǎn)也是免疫治療的理想靶點(diǎn)。

黏蛋白1（Mucin1，MUC1）是一種大分子跨膜糖蛋白，在多種腺癌中高表達(dá)，包括胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤，且相對(duì)于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面MUC1 錯(cuò)誤表達(dá)為糖基化異常。以MUC1 為靶點(diǎn)，構(gòu)建靶向MUC1 的CAR-T 細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)中分別檢測(cè)對(duì)肝癌細(xì)胞和正常組織的靶向殺傷作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向MUC1 的Jurkat CAR-T 細(xì)胞可特異性殺傷MUC1 高表達(dá)肝癌細(xì)胞，為靶向腫瘤特異性糖基化位點(diǎn)MUC1 的CAR 修飾患者原代T 細(xì)胞用于肝癌臨床治療提供可靠依據(jù)［7］。POSEY等［8］發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞白血病和胰腺癌異種移植模型中，抗Tn-MUC1 CAR-T 細(xì)胞具有靶向細(xì)胞毒性，并成功控制腫瘤生長(zhǎng)，證明了靶向Tn-MUC1的CAR-T 治療效果，并提出了異常糖基化抗原可作為工程化T 細(xì)胞治療腫瘤的新靶點(diǎn)。

2.3 “邏輯門(mén)”設(shè)計(jì)

2.3.1 雙特異性CAR CAR-T 療法在臨床應(yīng)用應(yīng)嚴(yán)格確保其安全性，僅高于正常組織表達(dá)的單一靶抗原顯然無(wú)法滿足其安全性要求，因此另一種解決脫靶效應(yīng)的方法應(yīng)運(yùn)而生。

將靶向2種不同抗原的scFv分別與激活信號(hào)和共刺激信號(hào)連接，識(shí)別第一抗原的scFv 與激活信號(hào)相連，識(shí)別第二抗原的scFv 與共刺激信號(hào)相連，CAR-T 細(xì)胞僅能靶向識(shí)別同時(shí)表達(dá)這2 種抗原的組織或細(xì)胞（圖1），增強(qiáng)其特異性，從而避免脫靶效應(yīng)［9］。 WILKIE 等［10］設(shè)計(jì)出 靶向 乳腺癌2 種 抗原ErbB2 和MUC1 的雙特異性CAR-T 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶細(xì)胞共表達(dá)ErbB2 和MUC1 下T 細(xì)胞才能有效殺傷腫瘤細(xì)胞并擴(kuò)增，且對(duì)僅表達(dá)單一抗原的細(xì)胞無(wú)影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有用于T 細(xì)胞活化識(shí)別的第一抗原Meso，也有用于T 細(xì)胞共刺激識(shí)別的第二抗原FRa［11］。

圖1 雙特異性CAR作用機(jī)制模型［9］Fig.1 Model of bi-specific CAR action mechanism［9］

2.3.2 iCAR 免疫檢測(cè)點(diǎn)如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）、細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）、B 和T 細(xì)胞衰減器（B and T cell attenuator，BTLA）等分子在正常情況下可競(jìng)爭(zhēng)性抑制T 細(xì)胞活化及其他功能，同時(shí)在腫瘤組織中可能被用于誘導(dǎo)免疫逃逸，近年受到廣泛關(guān)注［12-13］。

CAR-T 細(xì)胞對(duì)靶抗原表達(dá)的腫瘤組織和正常組織均有殺傷作用，一種可供選擇的解決方法是應(yīng)用iCAR［9］。iCAR 是在原有CAR 基礎(chǔ)上合成的抑制性CAR，不同于雙特異性CAR，合成的抑制性CAR識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面TAA 的同時(shí)，其表面抑制性受體可識(shí)別存在于正常細(xì)胞而腫瘤細(xì)胞中不存在的抗原（圖2），既保證對(duì)腫瘤的正常靶向殺傷作用，也保護(hù)正常細(xì)胞免受CAR-T 細(xì)胞靶向損傷，F(xiàn)EDOROV等［14］通過(guò)構(gòu)建胞內(nèi)域抑制性分子PD-1 或CTLA4 受體的iCAR驗(yàn)證此方法可控制CAR-T活化及應(yīng)答。

圖2 iCAR作用機(jī)制模型［14］Fig.2 Model of iCAR action mechanism［14］

2.3.3 SynNotch 受體 另一種有效增強(qiáng)治療性T 細(xì)胞靶向性的方法是合成Notch 受體（SynNotch 受體），ROYBAL 等［15］構(gòu)建1 個(gè)組合激活的T 細(xì)胞回路，其中識(shí)別1個(gè)TAA 的合成Notch 受體誘導(dǎo)第2個(gè)TAA 的CAR 表達(dá)，這些雙受體“AND”邏輯門(mén)控T 細(xì)胞僅在雙抗原腫瘤細(xì)胞存在下才被激活（圖3）。Notch 信號(hào)通路是癌癥中最常激活的信號(hào)通路，是癌癥治療與研究的新靶點(diǎn)［16-17］。

圖3 SynNotch受體作用機(jī)制模型［15］Fig.3 Mechanism model of SynNotch receptor［15］

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）同質(zhì)性表達(dá)于卵巢癌、乳腺癌、肺腺癌，在一些正常組織如甲狀旁腺、胰島、食管部分區(qū)域、胃和十二指腸也有表達(dá)［18］。SRIVASTAVA 等［19］設(shè)計(jì)靶向ROR1 的CAR-T細(xì)胞表達(dá)針對(duì)腫瘤抗原EpCAM 或B7-H3 的Syn-Notch 受體，該抗原表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而非基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明B7-H3 更適合于臨床SynNotch 靶點(diǎn)應(yīng)用，邏輯門(mén)控應(yīng)用為CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤拓寬了道路。

2.4 導(dǎo)入自殺基因 目前基因治療中常用的自殺基因包括單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）基因、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因caspase-9（iCasp9）和EGFRt 基因。 iCasp9 和EGFRt 基因是人源性蛋白，二者免疫原性較低，而HSV-TK 免疫原性較高。HSV-TK 可磷酸化特定核苷類(lèi)似物，如鳥(niǎo)嘌呤核苷類(lèi)似物更昔洛韋（GCV），形成三磷酸產(chǎn)物并結(jié)合至DNA，導(dǎo)致抑制DNA合成并導(dǎo)致分裂的細(xì)胞死亡（圖4A）［20］。HSV-TK多用于控制移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD），療效較好，但其缺陷性在于HSV-TK免疫原性導(dǎo)致正常免疫系統(tǒng)消除轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細(xì)胞，以及臨床上出現(xiàn)與使用前藥GCV 進(jìn)行治療不相容現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細(xì)胞不必要消除［21-22］。iCasp9 系統(tǒng)包括iCasp9基因和化學(xué)誘導(dǎo)二聚反應(yīng)（CID）藥物。iCasp9 基因與來(lái)自人FK506 結(jié)合蛋白的藥物結(jié)合域融合，AP1903可使該融合蛋白藥物結(jié)合區(qū)交聯(lián)，激活下游caspase-3 分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（圖4B）［23］。WITTE等［24］將iCasp9M 安全開(kāi)關(guān)用于誘導(dǎo)糖尿病小鼠細(xì)胞治療發(fā)現(xiàn)，由于iCasp9 系統(tǒng)可直接激活效應(yīng)者半胱天冬酶如caspase-3，7，9，相較于其他系統(tǒng)，iCasp9系統(tǒng)可更為快速地消除T 細(xì)胞，因此這個(gè)開(kāi)關(guān)的觸發(fā)可有效阻止正在進(jìn)行的、有致命風(fēng)險(xiǎn)的自身免疫攻擊。 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）廣泛分布于人體細(xì)胞表面，WANG等［25］通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒將人EGFR 多肽轉(zhuǎn)染至CAR-T細(xì)胞膜，當(dāng)發(fā)生不良反應(yīng)時(shí)，采用西妥昔單抗可消除轉(zhuǎn)染的CAR-T細(xì)胞（圖4C）。相對(duì)于基于CD20表達(dá)及利妥昔單抗應(yīng)用的方法，此法不會(huì)引起正常B細(xì)胞消除。

圖4 3種自殺基因作用機(jī)制模型［16］Fig.4 Three models of action mechanism of suicide genes［16］

2.5 腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗原外表達(dá) 尋找新型腫瘤特異性抗原對(duì)于CAR-T 細(xì)胞成功治療實(shí)體腫瘤至關(guān)重要，腫瘤特異性抗原分布于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)，有研究提出，既然腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原較為缺乏，可轉(zhuǎn)向應(yīng)用腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性抗原，且多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原屬于腫瘤特異性抗原。

細(xì)胞內(nèi)抗原加工提呈給免疫系統(tǒng)主要通過(guò)MHCⅠ類(lèi)途徑，又稱(chēng)胞質(zhì)溶膠途徑：細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性抗原在蛋白酶體及其他蛋白水解酶下降解，產(chǎn)生適合與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合的短肽，抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）將內(nèi)源性Ag 肽從蛋白酶體轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），鈣網(wǎng)蛋白參與下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的MHCⅠ類(lèi)分子荷肽轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，被CD8+Tc 識(shí)別殺傷（圖5）［26-28］。荷肽復(fù)合物（peptide-loading complex，PLC）包括TAP、TAP 相關(guān)蛋白、MHCⅠ、ERp57 和鈣網(wǎng)蛋白，PLC 確保MHCⅠ類(lèi)分子負(fù)荷有效的抗原肽，另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶相關(guān)處理（ER aminopeptidase associated with antigen processing，ERAAP）可能也參與多肽加工處理使其適于MHCⅠ類(lèi)分子負(fù)荷，而這些因子在細(xì)胞暴露于IFN-γ時(shí)表達(dá)上調(diào)［29］。

圖5 基本的MHCⅠ類(lèi)抗原呈遞途徑［26］Fig.5 Basic MHCⅠantigen presentation pathways［26］

GERBER 等［30］也提出胞內(nèi)靶抗原表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，HLA 提呈胞內(nèi)抗原表位密度遠(yuǎn)低于細(xì)胞表面抗原密度以及需要一系列加工才能與HLA復(fù)合物結(jié)合等問(wèn)題為未來(lái)選擇性腫瘤特異性、胞內(nèi)靶抗原應(yīng)用提供了方向。

2.6 單克隆抗體封閉靶抗原 向患者輸注提前設(shè)計(jì)好的CAR-T 細(xì)胞前，采用針對(duì)該TAA 的單克隆抗體預(yù)先封閉正常組織低表達(dá)靶抗原，可有效減少后續(xù)治療中可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)。LAMERS等［31］設(shè)計(jì)靶向CAIX 的CAR-T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者，將接受CAT-T 細(xì)胞治療的患者分為3組，為管理患者脫靶毒性，輸注CAR-T 細(xì)胞前3 d 向其中一組的4 位患者靜脈注射抗CAIX 單克隆抗體G250，隨后輸注CAR-T 細(xì)胞，立即監(jiān)測(cè)肝臟活性，該組患者并未觀察到肝臟毒性，但該方法能否用于其他CAIX靶向正常組織導(dǎo)致的脫靶毒性仍需進(jìn)一步研究。

2.7 親和力轉(zhuǎn)變 當(dāng)二價(jià)配體的2 個(gè)藥效團(tuán)同時(shí)結(jié)合至其靶位時(shí)，其表現(xiàn)出顯著親和力和靶停留時(shí)間增加，由于1 個(gè)藥效團(tuán)結(jié)合迫使第2 個(gè)保留的藥效團(tuán)靠近其相應(yīng)位置；此外，這種“強(qiáng)制接近”產(chǎn)生局部高濃度的游離藥物團(tuán)也將顯著增加其再次與原靶點(diǎn)結(jié)合的機(jī)會(huì)，引發(fā)“重新綁定”［32］。采用二價(jià)配體結(jié)合特性可幫助優(yōu)化腫瘤抗原靶向性，同時(shí)保留低靶向性的正常組織。

CD38 在所有多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞呈高表達(dá)，但在一些造血細(xì)胞上呈中等水平表達(dá)，包括自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和小部分T 細(xì)胞。DRENT等［33］提出一種新的可行的技術(shù)產(chǎn)生一群具有不同親和力的抗體，通過(guò)系統(tǒng)分析篩選出合適的單鏈抗體使CARs 可有效靶向腫瘤，而脫靶效應(yīng)較小或沒(méi)有，證明單鏈抗體可選擇性靶向TAA，如MM 的CD38，且對(duì)靶抗原具有最佳親和力。

2.8 其他 改變T細(xì)胞輸注途徑，如胸膜內(nèi)注射靶向間皮素的CAR-T 細(xì)胞治療惡性胸膜腫瘤，顱內(nèi)注射治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，瘤內(nèi)注射使多數(shù)CART 細(xì)胞聚集于病灶范圍內(nèi)，強(qiáng)化治療效果，同時(shí)限制其對(duì)正常組織的靶向毒性［34-35］；mRNA 電穿孔技術(shù)用于CAR-T 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，CAR 瞬時(shí)表達(dá)，可較好調(diào)控治療過(guò)程中的不良反應(yīng)［36］；控制CAR-T 細(xì)胞輸注劑量，通常CAR-T 細(xì)胞劑量與毒性呈正相關(guān)，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇首次治療的CAR-T 細(xì)胞劑量，臨床治療中可平穩(wěn)提高輸注劑量；通過(guò)感知腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），如缺氧和酸性環(huán)境等，使CAR-T 細(xì)胞僅能在腫瘤位點(diǎn)激活，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞，提高CAR-T 安全性；脫靶毒性往往與各種細(xì)胞因子釋放密切相關(guān)，臨床上避免脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的同時(shí)也需要重視對(duì)細(xì)胞因子釋放綜合征的治療。

3 結(jié)語(yǔ)

近年CAR-T 療法在血液系統(tǒng)治療中取得了良好療效，研究者堅(jiān)信其在實(shí)體瘤治療中同樣具有巨大潛力。實(shí)體腫瘤高異質(zhì)性及腫瘤特異性抗原缺乏導(dǎo)致CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤中出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)是其應(yīng)用中的較大障礙。避免脫靶效應(yīng)產(chǎn)生有2個(gè)思路：一是增強(qiáng)CAR-T 對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性；二是抑制CAR-T 靶向殺傷正常細(xì)胞。目前提出的針對(duì)脫靶效應(yīng)的優(yōu)化策略多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，很難在人體中完全再現(xiàn)，從臨床前試驗(yàn)到臨床應(yīng)用過(guò)程漫長(zhǎng)而艱辛。雖然這些策略可能存在不足，需要改進(jìn)或優(yōu)化，但課題組相信隨著免疫學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，下一代CAR-T 細(xì)胞可表現(xiàn)出更優(yōu)越的安全性和有效性，脫靶效應(yīng)及其他毒副反應(yīng)發(fā)生率將不斷降低，必將給實(shí)體腫瘤患者帶來(lái)希望。