嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)在過敏性疾病應(yīng)用中的研究進(jìn)展①

張 敏 崔振澤 李 悅 徐 超

（大連市兒童醫(yī)院，大連116000）

雖然世界醫(yī)療水平、工業(yè)發(fā)展程度以及感染性疾病的防治水平不斷提高，但是過敏性疾病的發(fā)病率卻在全球呈現(xiàn)增高的趨勢，嚴(yán)重影響公共健康，已成為21 世紀(jì)需著重研究和防治的疾病之一［1］。臨床工作中主要根據(jù)相關(guān)病史以及體內(nèi)和體外試驗(yàn)對過敏性疾病作出診斷，但因描述病史有一定的不精確性和主觀性，故主要診斷依據(jù)為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)［2］。目前常用的體內(nèi)試驗(yàn)包括皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、斑貼試驗(yàn)、激發(fā)試驗(yàn)；常用的體外試驗(yàn)包括過敏原吸附試驗(yàn)、嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)以及特異性IgE 及IgG 檢測等［3］。其中體內(nèi)試驗(yàn)存在誘發(fā)過敏反應(yīng)的潛在風(fēng)險。傳統(tǒng)體外試驗(yàn)具有易干擾、特異度低等缺點(diǎn)，如特異性IgE 檢測不能評估過敏性疾病的發(fā)病風(fēng)險及嚴(yán)重程度［4-5］；嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)（histamine release test，HRT）由于組胺來源的多樣性使得其敏感性低于體內(nèi)試驗(yàn)等［6］。因此臨床工作中亟需進(jìn)一步探索安全簡便有效的輔助診斷過敏性疾病的檢測方法。

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）可快速簡便的通過識別免疫標(biāo)志物來區(qū)分細(xì)胞類型，并對某種特定細(xì)胞進(jìn)行定量分析［7］。微流體技術(shù)（microfluidic technology）是在FCM基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展起來的一種高精度處理小體積流體的技術(shù)［8］。近年來，在上述兩種技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)（basophil activation test，BAT）作為一種輔助診斷過敏性疾病的新方法應(yīng)用而生。本文就嗜堿性粒細(xì)胞的相關(guān)概念、分別基于FCM 及微流體技術(shù)的BAT及其對過敏性疾病輔助診斷的應(yīng)用價值做一綜述，以期為今后過敏性疾病的臨床診斷提供相關(guān)理論指導(dǎo)。

1 嗜堿性粒細(xì)胞的相關(guān)概念

1.1 嗜堿粒細(xì)胞 嗜堿性粒細(xì)胞于1879年由EHRLICH 發(fā)現(xiàn)，是迄今為止研究較少的一類白細(xì)胞。由于嗜堿性粒細(xì)胞占外周血白細(xì)胞的比例很小（＜0.3%），所以既往通過分離培養(yǎng)來獲得純的嗜堿性粒細(xì)胞樣本進(jìn)行研究，進(jìn)而檢測并分析其釋放組胺、白三烯及細(xì)胞因子等情況［9］。然而因采血量大，步驟繁多，耗時較長，影響因素多等局限在很長一段時間內(nèi)限制了該細(xì)胞的研究進(jìn)展。

近年來隨著科技水平的提高，嗜堿性粒細(xì)胞的提純方法也逐漸興起，如流式細(xì)胞分選術(shù)以及磁珠負(fù)性選擇和密度梯度離心相結(jié)合的純化方法，使得高純度的嗜堿性粒細(xì)胞更為簡便，因此科學(xué)界對嗜堿性粒細(xì)胞的研究掀起了新的熱潮。有學(xué)者曾將此現(xiàn)象稱為“ 一個被忽視的小群體重新贏得了尊重”［10-11］。

嗜堿性粒細(xì)胞源自骨髓造血多能干細(xì)胞，在骨髓中成熟后分布于外周血［12］。該細(xì)胞廣泛存在于生物界，如在哺乳類、兩棲類和魚類等均存在［13］。正是該細(xì)胞存在的廣泛性揭示了其在生命活動過程中的必要性，具體表現(xiàn)為該細(xì)胞在IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)中扮演著重要的角色。其胞漿中的嗜堿性顆粒內(nèi)貯存有大量的炎癥介質(zhì)，如組胺、白三烯、抗微生物肽、趨化因子及白細(xì)胞介素等［14］。當(dāng)機(jī)體初次接觸過敏原時，在體液免疫作用下漿細(xì)胞便產(chǎn)生針對過敏原的特異性IgE 抗體，這些特異性IgE 抗體可與嗜堿性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞表面的高親和力IgE 受體（FcεRⅠ）結(jié)合，使嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸同種過敏原時，即使很小劑量進(jìn)入機(jī)體，便可很快與致敏嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的IgE 結(jié)合，通過交聯(lián)作用使上述致敏細(xì)胞激活、脫顆粒并釋放胞漿中的炎癥介質(zhì)，誘發(fā)不同程度的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時可產(chǎn)生致命的全身性反應(yīng)。因此嗜堿性粒細(xì)胞也被稱為“循環(huán)中的肥大細(xì)胞”，具有免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答的作用［15］。

嗜堿性粒細(xì)胞通過活化來參與多種變態(tài)反應(yīng)性疾病，如過敏性支氣管哮喘、蕁麻疹等［16-23］?；罨瞧浒l(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵。一方面與該細(xì)胞活化分泌多種炎癥介質(zhì)相關(guān)，如過敏性支氣管哮喘作為常見的氣道過敏性疾病，在其發(fā)病過程中處于致敏狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞在變應(yīng)原的刺激下活化分泌組胺、白三烯、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、中性粒細(xì)胞趨化因子及血小板活化因子等炎癥介質(zhì)，可使支氣管黏膜血管通透性增加，進(jìn)而介導(dǎo)氣道炎癥的產(chǎn)生、氣道平滑肌的收縮及氣道黏液的分泌，使氣道處于高反應(yīng)性狀態(tài)，誘導(dǎo)支氣管哮喘的發(fā)生［16-17］；再如蕁麻疹作為一種臨床常見的皮膚過敏性疾病，有研究報道其發(fā)病與嗜堿性粒細(xì)胞活化分泌組胺、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等炎癥介質(zhì)相關(guān)，在這些炎癥介質(zhì)的作用下皮膚及黏膜小血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)而出現(xiàn)皮膚潮紅、風(fēng)團(tuán)樣皮疹的臨床表現(xiàn)［18］。另一方面與該細(xì)胞活化后誘導(dǎo)Th1/Th2 免疫失衡相關(guān)，主要表現(xiàn)為Th2 免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為支氣管哮喘的氣道慢性炎癥與Th1/Th2 細(xì)胞比例失衡相關(guān)，具體表現(xiàn)為Th2 細(xì)胞數(shù)目的增加及功能的增強(qiáng)［19-20］。而有研究報道嗜堿性粒細(xì)胞在活化后可產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞因子如IL-4、IL-13 等，可介導(dǎo)局部引流淋巴結(jié)內(nèi)Th0 向Th2 細(xì)胞分化，使Th2 免疫應(yīng)答增強(qiáng)的同時Th1 免疫應(yīng)答得到抑制，同時可促進(jìn)B 細(xì)胞分泌IgE 抗體［21-22］，進(jìn)而來參與支氣管哮喘的發(fā)生；同樣蕁麻疹的發(fā)病亦與相應(yīng)變應(yīng)原誘導(dǎo)的以Th2 細(xì)胞為主的免疫失衡相關(guān)［23］。

目前研究發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞的活化途徑包括IgE 介導(dǎo)的活化和非IgE 介導(dǎo)的活化。其中經(jīng)典的活化途徑為IgE 介導(dǎo)的活化，表現(xiàn)為：當(dāng)機(jī)體首次受抗原刺激后，可產(chǎn)生抗原特異性IgE，并與體內(nèi)已存在的IgE 受體結(jié)合，其中嗜堿性粒細(xì)胞表面常規(guī)表達(dá)有高親和性IgE 受體，故當(dāng)其與抗原特異性IgE 結(jié)合后可使嗜堿性粒細(xì)胞致敏［24］。當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體并與致敏嗜堿性粒細(xì)胞膜表面的抗原特異性IgE 結(jié)合后，嗜堿性粒細(xì)胞可通過胞吐的過程來釋放胞漿嗜堿性顆粒內(nèi)的相關(guān)炎癥介質(zhì)，如嗜堿性粒細(xì)胞趨化因子和組織胺等，進(jìn)而參與過敏反應(yīng)的發(fā)生。非IgE 介導(dǎo)的活化途徑包括IgG1、IgD、細(xì)胞因子、蛋白酶以及Toll 樣受體配體和補(bǔ)體等介導(dǎo)的途徑［25］。

1.2 嗜堿性粒細(xì)胞表面的相關(guān)標(biāo)志物 嗜堿性粒細(xì)胞活化脫顆粒釋放各種炎癥介質(zhì)的同時，活化相關(guān)膜標(biāo)志物也在發(fā)生改變［26］。 主要包括CD45、CD203c、CD63、CD69、CD123、CCR3、CRTH2、CD13、CD107a、CD107b、CD164 等［27-28］。其中最常用的為CD203c和CD63。

1.2.1 CD63 CD63 又稱溶酶體相關(guān)膜蛋白3，表達(dá)于多種細(xì)胞膜表面，如活化的嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板及嗜酸性粒細(xì)胞等［29-32］。作為嗜堿性粒細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物，對處于未激活狀態(tài)（靜息狀態(tài)）的嗜堿性粒細(xì)胞而言，CD63主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性顆粒膜表面，而在細(xì)胞膜表面幾乎不表達(dá)，表達(dá)量＜5%；對受抗原刺激處于活化狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞而言，其胞質(zhì)的嗜堿性顆粒逐漸向細(xì)胞膜靠近并與之發(fā)生融合，CD63發(fā)生由胞質(zhì)顆粒膜向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移，使得其在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量增多［33-34］。根據(jù)CD63 在嗜堿性粒細(xì)胞活化過程中表達(dá)上調(diào)的特點(diǎn)，便可對處于激活狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測，并計算其活化率。此外有學(xué)者進(jìn)一步提出通過量化嗜堿性粒細(xì)胞活化后細(xì)胞膜表面CD63 的表達(dá)量來評估嗜堿性粒細(xì)胞受變應(yīng)原刺激后的活化程度，進(jìn)而間接反應(yīng)機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)的程度［8］。

1.2.2 CD203c CD203c 是一種Ⅱ型糖基化跨膜分子，其表達(dá)于嗜堿性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，是嗜堿性粒細(xì)胞的識別標(biāo)志物及活化標(biāo)志物之一［35］。CD203c 既表達(dá)于靜息狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞，也表達(dá)于處于活化狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞。但不同的是其表達(dá)量隨著細(xì)胞活化程度的變化而變化，具體表現(xiàn)為在處于靜息狀態(tài)的細(xì)胞表面低表達(dá)，而在受抗原刺激處于激活狀態(tài)的細(xì)胞表面表達(dá)量則上調(diào)。此外有研究表明處于相同活化狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63 和CD203c 的表達(dá)情況存在差異，后者的表達(dá)量明顯優(yōu)于前者［36-37］。因此筆者認(rèn)為根據(jù)CD203c 的上述表達(dá)特點(diǎn)，可利用FCM對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測，并通過計數(shù)CD203c 表達(dá)量上調(diào)的細(xì)胞所占的比例來進(jìn)一步評估嗜堿性粒細(xì)胞的活化率。

1.2.3 CD45 CD45 是Ⅰ型跨膜糖蛋白，又稱白細(xì)胞共同抗原。作為一種受體蛋白酪氨酸磷酸酶，可參與細(xì)胞膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時作為有核血細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物，僅表達(dá)于除成熟紅細(xì)胞和血小板以外的所有有核血細(xì)胞表面，主要參與血細(xì)胞的發(fā)育、活化、衰老和凋亡，尤其對淋巴細(xì)胞的作用顯著，故在淋巴細(xì)胞膜表面的表達(dá)密度較高，依次是單核細(xì)胞、粒細(xì)胞，且CD45 的表達(dá)量隨細(xì)胞的成熟而增加［38-39］。筆者認(rèn)為CD45 可輔助其他標(biāo)志分子對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.4 其他表面分子 CCR3 是一種趨化因子受體，主要參與炎癥細(xì)胞的浸潤。其主要表達(dá)于嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞等細(xì)胞膜表面［40］。CD123 為白細(xì)胞介素3 受體的1 個亞單位，對白細(xì)胞介素3 有較高特異性，表達(dá)于嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞表面［41］。CRTH2是1種化學(xué)誘導(dǎo)趨向性受體，在人體外周血中主要表達(dá)于Th2 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞表面，其通過與前列腺素D2 結(jié)合介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤來參與過敏反應(yīng)的發(fā)生［42］。

2 BAT

2.1 FCM 及微流體技術(shù) FCM 是一種利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行快速細(xì)胞定量分析和細(xì)胞分選的技術(shù)，具有速度快、分析全面、可定性及定量分析、測量參數(shù)多、分選純度高等特點(diǎn)［7］。

微流體技術(shù)是一種高精度處理小體積流體的技術(shù)，通常只需微升到納升的標(biāo)本量［43］。微流控免疫親和細(xì)胞分離（microfluidic immunoaffinity cell separation）是一種特殊的細(xì)胞分離技術(shù)，即把可與目標(biāo)細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體固定在微流控芯片的表面，之后通過與細(xì)胞結(jié)合來捕獲細(xì)胞，再進(jìn)行光學(xué)檢測，對分離得到的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的研究。該技術(shù)曾被用于全血中淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞的分離［44］。

2.2 基于FCM 的傳統(tǒng)BAT 傳統(tǒng)的BAT 是在FCM的基礎(chǔ)上對嗜堿性粒細(xì)胞加以定性及定量分析的方法，其步驟為：每批標(biāo)本都需通過設(shè)立陽性對照與陰性對照來進(jìn)行檢測，其中抗FcεRⅠ抗體為陽性對照，刺激緩沖液為陰性對照［26］。將20 μl刺激緩沖液加入至100 μl 肝素化血液中孵育10 min，孵育時溫度控制在37℃；終止嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒通過置于冰箱冷卻5 min 實(shí)現(xiàn)；之后加入被標(biāo)記的相關(guān)檢測抗體（如被PE標(biāo)記的抗IgE抗體及被FITC標(biāo)記的抗CD63 或者被PE 標(biāo)記的CD203c 抗體及被FITC 標(biāo)記的抗CD63抗體），并于室溫下放置10 min，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與相應(yīng)抗體的結(jié)合；最后用溶血素處理溶解紅細(xì)胞，經(jīng)離心洗滌后通過流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)對嗜堿性粒細(xì)胞活化程度的定性和定量分析［45］。嗜堿性粒細(xì)胞活化程度用嗜堿性粒細(xì)胞活化率（即活化的嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)與總嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)的比值）來表示，通常活化率≥2% 可認(rèn)為嗜堿性粒細(xì)胞活化。但當(dāng)考慮到非特異性激活的因素時，活化率≥5% 考慮嗜堿性粒細(xì)胞活化［14，46］。國外也有學(xué)者提出用刺激指數(shù)（stimulation index，SI，即由過敏原激活的嗜堿性粒細(xì)胞百分比/自發(fā)激活的嗜堿性粒細(xì)胞百分比）來表示檢測結(jié)果，然而目前關(guān)于SI 的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)尚未確定，需要有待進(jìn)一步的研究［47］。

基于FCM 的傳統(tǒng)BAT 存在耗時長、成本高以及對操作技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，限制了其在臨床工作中的普及，目前國內(nèi)很多醫(yī)院尚未開展BAT，故亟需改良傳統(tǒng)BAT來滿足臨床需求。

2.3 基于微流體技術(shù)的新型BAT（miBAT） 在臨床需求的推動下，近年來瑞典有學(xué)者提出了miBAT，國內(nèi)尚未有關(guān)于miBAT 的文獻(xiàn)資料報道。其具體方法步驟為：第一步制備微流控芯片器件并進(jìn)行表面改性：①使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）平版印刷技術(shù)制備微流控器件；②經(jīng)氧等離子體的短暫處理將PDMS 復(fù)制品粘在玻璃載玻片（70 mm×30 mm）上；③用3-巰基丙基三甲氧基硅烷（3-mercaptopropyl trimethoxysilane）處理芯片1 h為后續(xù)的固定捕獲嗜堿性粒細(xì)胞的抗體（即抗CD203c生物素）做準(zhǔn)備；④用乙醇洗滌后，與0.01 μmol/ml 4-馬來酰亞胺丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester，GMBS）在乙醇中室溫孵育20 min；⑤先后用乙醇及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，加入10 μg/ml 中和素溶液并于PBS 中在4℃下孵育過夜；⑥于實(shí)驗(yàn)前，注入生物素化抗CD203c 并孵育60 min，完成捕獲抗體的固定，為后續(xù)捕捉嗜堿性粒細(xì)胞做準(zhǔn)備。第二步微流控芯片中嗜堿性粒細(xì)胞的捕獲：①在PBS 中用1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）以20 μl/min 的速度洗滌和封閉芯片，以去除未結(jié)合（抗CD203c 生物素）抗體；②200 μl 的全血以3 μl/min 的速度流過，然后用1%BSA 以20 μl/min 的速度將非嗜堿性粒細(xì)胞洗滌出去。第三步被捕獲嗜堿性粒細(xì)胞的過敏原激發(fā)：①每組均需設(shè)立陽性和陰性對照，其中抗FcεRⅠ抗體作為陽性對照，刺激緩沖液作為陰性對照。分別用相關(guān)過敏原、陽性及陰性對照液刺激被捕獲的嗜堿性粒細(xì)胞25 min；②用1%BSA 洗滌后，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）在室溫下固定10 min，然后清洗芯片；③用抗CD203c 抗體在室溫下孵育1 h，再用熒光結(jié)合Alexa-488 的二級抗鼠抗體在室溫下染色1 h；用Alexa-647結(jié)合的抗CD63抗體在室溫下孵育30 min 后檢測CD63 的活化，并用霍氏染色檢測細(xì)胞核；④用1%BSA 清洗芯片，Nikon-Ti-Eclipse 顯微鏡掃描，Zyla 5.5scmos 相機(jī)采集圖像，用MicroManager 1.4 版軟件傳輸，Image J 軟件插件處理。第四步微流控芯片中CD63 平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）的測量：熒光強(qiáng)度測量是用Image J軟件直接在細(xì)胞上的多個點(diǎn)進(jìn)行。圖像的深底為背景測量。熒光強(qiáng)度測量用背景測量和目標(biāo)測量的數(shù)值差表示。嗜堿性粒細(xì)胞的活化程度可以用嗜堿性粒細(xì)胞的MFI 比率（即活化嗜堿性粒細(xì)胞的MFI/非活化嗜堿性粒細(xì)胞的MFI表示）［8］。

目前國外學(xué)者提出可以通過預(yù)制芯片及用抗體涂層芯片，優(yōu)化流速和孵育程序來縮短試驗(yàn)時間，利用計算機(jī)軟件自動讀取和分析圖像，并對非活化細(xì)胞和活化細(xì)胞進(jìn)行自動識別，來進(jìn)一步優(yōu)化該試驗(yàn)［8］。

miBAT 無需預(yù)先標(biāo)記和處理樣品，可直接從全血中捕獲CD203c 陽性細(xì)胞（即嗜堿性粒細(xì)胞），并將捕捉到的嗜堿性粒細(xì)胞用抗FcRⅠ抗體激活，于熒光顯微鏡下檢測嗜堿性粒細(xì)胞CD63 的表達(dá)水平。微流體技術(shù)的引入成功的解決了基于FCM 的傳統(tǒng)BAT 存在的局限，不僅在降低成本的同時減少了對試劑量和生物樣本量的需求，而且可實(shí)現(xiàn)高通量自動化分析以及將多個操作步驟集成在一個設(shè)備的目標(biāo)，使得操作更簡便高效。

2.4 BAT 的常見門控策略 BAT 的核心在于對樣本進(jìn)行處理后篩選符合要求的嗜堿性粒細(xì)胞。下面介紹幾種常見的篩選門控策略：①IgE、CD63聯(lián)合設(shè)門。第一步通過前向角與側(cè)向角確定出嗜堿性粒細(xì)胞所在的大致區(qū)域，即白細(xì)胞群的區(qū)域；第二步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE 受體可與IgE 特異性結(jié)合的特點(diǎn)，利用IgE-FITC 對其進(jìn)行標(biāo)記，篩選嗜堿性粒細(xì)胞；第三步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞被激活后細(xì)胞膜表面有CD63 表達(dá)的特點(diǎn)，利用CD63 設(shè)門對處于活化狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行篩選，并由此計算嗜堿性粒細(xì)胞的活化率［48］。然而由于IgE 可能會非特異地與單核細(xì)胞、B 細(xì)胞等黏附，因此可能使嗜堿性粒細(xì)胞活化率略低。故筆者認(rèn)為在第一步操作時利用前向角與側(cè)向角來確定粒細(xì)胞群的區(qū)域可在一定程度上減少IgE 非特異性黏附帶來的誤差，但有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證；②IgE、CD45、CD63聯(lián)合設(shè)門。第一步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞表面表達(dá)有高親和性的IgE 受體及CD45 的特點(diǎn)利用FCM 篩選出嗜堿性粒細(xì)胞，第二步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞被激活后細(xì)胞膜表面表達(dá)CD63 的特點(diǎn)，利用CD63 設(shè)門將活化的嗜堿性粒細(xì)胞篩選出來，并由此計算出嗜堿性粒細(xì)胞活化率［34］；③IgE、CD45、CD203c 聯(lián)合設(shè)門。第一步同②設(shè)門思路，第二步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞被激活后高表達(dá)CD203c 的特點(diǎn)，利用CD203c 設(shè)門篩選出表達(dá)量明顯上調(diào)的細(xì)胞即活化嗜堿性粒細(xì)胞，并計算嗜堿性粒細(xì)胞活化率［34］；④CRTH2、CD4、CD63聯(lián)合設(shè)門。第一步利用CRTH2和SSC雙參數(shù)設(shè)門選取CRTH2陽性細(xì)胞；第二步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞表面CRTH2 陽性且CD4 陰性的特點(diǎn)，利用CD4 聯(lián)合CRTH2 設(shè)門對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行篩選；第三步在上述篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上利用CD63 設(shè)門將活化的嗜堿性粒細(xì)胞篩選出來，并計算出嗜堿性粒細(xì)胞活化率［49］；⑤CD123、HLA-DR、CD63 聯(lián)合設(shè)門。第一步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞表面CD123 陽性且HLADR陰性的特點(diǎn)，利用CD123和HLA-DR設(shè)門篩選嗜堿粒細(xì)胞，第二步在上述操作的基礎(chǔ)上利用CD63設(shè)門篩選出活化的嗜堿粒細(xì)胞，并計算出嗜堿性粒細(xì)胞活化率［50-51］。但由于CD123 并不是特異性存在于嗜堿性粒細(xì)胞表面，也表達(dá)于血液中的中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面，故該設(shè)門法存在一定局限，可能會使得到的活化率偏低；⑥CD45、CD63、CD203c 聯(lián)合設(shè)門［26］。根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞表面表達(dá)有CD203c 及CD45 的特點(diǎn)，第一步利用CD45 和SSC 雙參篩選出CD45 陽性的細(xì)胞即有核細(xì)胞，第二步利用CD203c和SSC雙參數(shù)篩選出CD203c陽性的細(xì)胞，第三步在上述篩選基礎(chǔ)上再次通過CD45 和SSC 回選，確定CD203c 和CD45 雙陽性的細(xì)胞，即為純的嗜堿性粒細(xì)胞；第四步根據(jù)嗜堿性粒細(xì)胞活化后表面高表達(dá)有CD63 及CD203c 的特點(diǎn)，通過CD63 聯(lián)合CD203c篩選出活化的嗜堿性粒細(xì)胞，并計算嗜堿性粒細(xì)胞活化率。

綜上所述，筆者認(rèn)為上述⑥的設(shè)門思路是一種最優(yōu)的設(shè)門思路［26，52］。國內(nèi)有相關(guān)研究便是采用該設(shè)門思路，如徐翀等［26］研究戶塵螨過敏性疾病時便是采用該設(shè)門思路，并將試驗(yàn)結(jié)果與血清sIgE 及SPT 的結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)該設(shè)門思路的BAT 較sIgE 法而言在敏感度、假陰性率及陽性預(yù)測值方面均占有優(yōu)勢。再如劉欣躍等［52］采用該設(shè)門思路的BAT 研究診斷藥物過敏時得出相同的結(jié)論，進(jìn)一步證實(shí)該設(shè)門思路的可行性。該設(shè)門思路的優(yōu)勢具體表現(xiàn)為：一方面利用CD203c 聯(lián)合CD45 對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分離較IgE 設(shè)門法而言效果更好，很好地避免了IgE非特異地黏附于血液中的單核細(xì)胞、B細(xì)胞等導(dǎo)致的誤差；另一方面利用CD63 和CD203 聯(lián)合設(shè)門對活化的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行篩選可有效提高篩選的精確性。然而實(shí)踐工作中有待對不同設(shè)門思路進(jìn)行對照研究來進(jìn)一步對BAT的設(shè)門進(jìn)行規(guī)范。

3 BAT在過敏性疾病診斷中的應(yīng)用

BAT 作為一種安全高效的輔助診斷過敏性疾病的方法，已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可。國外已有關(guān)于BAT 用于診斷花粉、屋塵螨、藥物、食物等過敏反應(yīng)的報道。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CD203c 不僅在診斷人體對昆蟲毒液過敏時的敏感性高，而且與進(jìn)行毒液脫敏治療時副作用的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)［53］。因此可通過檢測CD203c 的表達(dá)來評估毒液脫敏治療過程中副作用的發(fā)生風(fēng)險。此外有研究報道哮喘患兒嗜堿性粒細(xì)胞CD63、CD203c 水平雖與病情的嚴(yán)重程度無關(guān)，但與患兒的哮喘急性發(fā)作次數(shù)呈正相關(guān)，即隨著CD63、CD203c 的表達(dá)量上調(diào)，其發(fā)病次數(shù)增多［54］。因此可通過檢測哮喘患兒治療前后嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63、CD203c 的表達(dá)水平來評估哮喘的治療效果，及時采取措施預(yù)防哮喘的急性發(fā)生。由此可見BAT 不僅可用于輔助診斷過敏性疾病，而且還可以通過評估嗜堿性粒細(xì)胞的過敏原閾值來監(jiān)測免疫治療過程中副反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險，指導(dǎo)臨床的預(yù)防工作。

關(guān)于藥物誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)，有學(xué)者通過研究藥物誘發(fā)的急性間質(zhì)性腎炎（acute interstitial nephritis，AIN），認(rèn)為BAT 可用于輔助診斷藥物超敏反應(yīng)引起的AIN，且認(rèn)為當(dāng)嗜堿性粒細(xì)胞的激活率＞5% 且刺激指數(shù)＞2 時，便可得到臨床證實(shí)［9］。因此BAT 有望成為臨床工作中及時對藥物過敏做出診斷的有效輔助工具。

此外國外學(xué)者對日光性蕁麻疹的研究表明，嗜堿性粒細(xì)胞在血清光過敏原刺激下通過IgE 介導(dǎo)的途徑發(fā)生活化，并提出BAT 有望成為檢測血清光致敏原的新方法，但需要對更多的日光性蕁麻疹患者進(jìn)行研究［55］?？梢夿AT 在診斷不同過敏性疾病方面有廣闊的應(yīng)用空間，有待進(jìn)一步探索。

4 BAT的局限與展望

4.1 BAT 的局限 目前雖有關(guān)于BAT 輔助過敏性疾病診斷的研究報道，但尚未建立公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方案。具體從以下4 點(diǎn)來闡明：①關(guān)于標(biāo)本的保存條件、保存時間范圍尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于不同保存條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響以及最佳的保存條件仍需進(jìn)一步研究；②關(guān)于樣本的處理，全血法可能會有血清成分的干擾，嗜堿性粒細(xì)胞分離法可能會使體外激活而導(dǎo)致假陽性；③關(guān)于BAT 檢測指標(biāo)的選擇標(biāo)準(zhǔn)仍需進(jìn)一步探索，如何根據(jù)不同的條件選擇合適的設(shè)門指標(biāo)仍有待研究；④關(guān)于檢測結(jié)果假陰性及假陽性的尚未有統(tǒng)一的處理標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 BAT的展望 BAT較體內(nèi)試驗(yàn)而言更安全、高效、特異，較體外試驗(yàn)如特異性IgE 檢測而言避免了交叉反應(yīng)的影響，更加特異、精確，再如較嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)而言避免了組胺來源多樣性的干擾，更具特異性、更易操作。BAT 彌補(bǔ)了目前過敏性疾病體內(nèi)和體外試驗(yàn)室診斷方法的不足，有助于更加全面的認(rèn)識過敏性疾病。綜上所述，相信進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化后的BAT 將因其安全有效的特點(diǎn)得到普及，成為未來IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)的首選診斷方法，為無數(shù)過敏性疾病患者帶來福音。