肺炎克雷伯菌生物膜形成及調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

賈 雯，郭瑞林，2

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712000 2陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，陜西咸陽 712000

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KPN)是一種醫(yī)院內(nèi)常見感染菌，現(xiàn)也可引起嚴(yán)重的社區(qū)感染，因KPN高產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶，2017年WHO已經(jīng)將KPN列為具有“危急威脅”的細(xì)菌[1- 2]。研究表明60%～80%的細(xì)菌感染，尤其是設(shè)備相關(guān)感染和慢性感染是由細(xì)菌形成生物膜引起的，生物膜形成使細(xì)菌對宿主防御機(jī)制的抵抗力增強(qiáng)，臨床常規(guī)抗菌治療無效[3- 4]。此外，生物膜可促進(jìn)細(xì)菌間基因水平傳播，主要的機(jī)制有：生物膜形成使細(xì)菌密度增加并降低了菌間的空間距離，為基因水平轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供有利條件；生物膜中細(xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄增加，其形成增高了細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移頻率；同時，也有研究顯示生物膜引起的嚴(yán)格反應(yīng)可上調(diào)細(xì)菌整合子的表達(dá)，整合子介導(dǎo)細(xì)菌抗生素耐藥基因的傳播[5- 7]。對KPN的研究顯示生物膜形成與耐碳青霉烯的分離株之間存在顯著相關(guān)性，碳青霉烯類抗生素被稱為“最后的抗生素”，而耐碳青霉烯KPN(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)除了對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外，這些菌株的耐藥基因還可以通過水平轉(zhuǎn)移在不同的細(xì)菌物種之間傳播，生物膜的形成使傳播變的更頻繁[3，8]。因此，對KPN生物膜形成因素及調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究是臨床迫切需要解決的問題，也可為臨床抗生物膜感染治療以及新藥研發(fā)提供新的方向。本文就KPN生物膜形成的因素及調(diào)控機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

生物膜的形成

生物膜是細(xì)菌附著在生物或非生物表面的微生物群落，細(xì)菌從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬顟B(tài)是一個受到環(huán)境與遺傳因素高度調(diào)控的過程。生物膜形成的過程主要包括：可逆附著階段、細(xì)菌黏附聚集階段、增殖階段、生物膜成熟階段、擴(kuò)散/分離階段。浮游細(xì)菌受環(huán)境刺激對各種環(huán)境信號做出應(yīng)答，附著在物體表面形成菌落；在菌落群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用下持續(xù)產(chǎn)生由多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組成的水合基質(zhì)成熟為大菌落；隨著時間的推移細(xì)菌可以從成熟的生物膜中分離，回到浮游狀態(tài)，在新的表面形成生物膜。KPN生物膜的形成主要受菌毛、多糖、群體感應(yīng)系統(tǒng)、外排泵等因素的影響，菌毛和多糖主要發(fā)揮黏附和組成生物膜結(jié)構(gòu)的作用，其中菌毛的黏附作用主要受c-di-GMP分子調(diào)控，莢膜多糖與脂多糖是生物膜形成中多糖黏附的主要成分，其調(diào)控受到環(huán)境中碳源的影響，群體感應(yīng)系統(tǒng)則通過細(xì)菌分泌的信號分子協(xié)調(diào)菌群密度，促進(jìn)生物膜成熟，外排泵的高表達(dá)在成熟生物膜中發(fā)揮作用[9]。

KPN生物膜形成的影響因素及調(diào)控機(jī)制

菌毛在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制菌毛是腸桿菌的外部結(jié)構(gòu)，主要促進(jìn)細(xì)菌附著介質(zhì)表面、細(xì)菌聚集和生物膜的形成。KPN主要產(chǎn)生Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛參與生物膜的形成[10]。Ⅰ型菌毛由Fim基因簇編碼，其中FimA基因編碼的蛋白構(gòu)成菌毛主要亞基，F(xiàn)imH蛋白是位于菌毛尖端的黏附素，主要黏附表面含有甘露糖成分的物質(zhì)如泌尿生殖道上皮細(xì)胞，促進(jìn)生物膜形成，導(dǎo)致難治性尿路感染發(fā)生；由mrkABCDF操縱子編碼的Ⅲ型菌毛，主要由菌毛亞單位MrkA和小分子黏附素MrkD組成，在人體內(nèi)外均介導(dǎo)生物膜的形成。MrkD促進(jìn)KPN黏附不同類型的細(xì)胞如氣管上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞等，在人體內(nèi)形成生物膜；MrkA則主要黏附于非生物材料表面，啟動KPN在留置的導(dǎo)管和氣管內(nèi)管上形成生物膜[11]。研究顯示KPN產(chǎn)生的KPF菌毛和ECP菌毛可能也參與生物膜的形成，其調(diào)控機(jī)制是否與鐵吸收相關(guān)蛋白Fur蛋白相關(guān)還需進(jìn)一步研究[12- 13]。而KPN菌毛除了在生物膜形成初始階段發(fā)揮作用外，也可維持莢膜多糖結(jié)構(gòu)流動性，這種流動性有利于KPN之間高效黏附以形成成熟穩(wěn)定的生物膜[14- 15]。

對KPN菌毛的形成進(jìn)行調(diào)控以抑制菌毛表達(dá)或破壞菌毛結(jié)構(gòu)，可防止細(xì)菌發(fā)揮黏附作用，影響生物膜形成，有效控制疾病感染[16]。目前發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)KPN發(fā)揮黏附與侵襲作用的膜蛋白的缺失會下調(diào)Ⅰ型菌毛的表達(dá)，進(jìn)而減弱細(xì)菌的黏附定植能力。研究顯示三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族的Sap(sensitivity to antimicrobial peptides，Sap)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KPN黏附人肝細(xì)胞和各種上皮細(xì)胞(如腸、肺和膀胱上皮細(xì)胞)的必需蛋白，SapA蛋白缺失的KPN可顯著下調(diào)Ⅰ型菌毛FimA蛋白的表達(dá)，明顯降低KPN腸道定植能力[17]。同時，有研究表明細(xì)胞內(nèi)增殖F(intracellular multiplication F，IcmF)家族蛋白是組成Ⅳ型分泌系統(tǒng)T6SS的保守內(nèi)膜蛋白，促進(jìn)KPN在宿主體內(nèi)的黏附與侵襲，而IcmF1/IcmF2蛋白缺失的突變株下調(diào)Ⅰ型菌毛轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低KPN定植能力，但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究[18]。脂蛋白BamB是錨定在革蘭陰性菌外膜蛋白周質(zhì)面的輔助結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)缺失使KPN的Fim基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，Ⅰ型菌毛產(chǎn)生降低32倍，但因脂蛋白BamB缺失表達(dá)影響外膜結(jié)構(gòu)的完整性，對Ⅰ型菌毛的調(diào)控還需進(jìn)一步研究[19]。除了Ⅰ型菌毛，大量研究表明Ⅲ型菌毛是KPN生物膜形成的主要影響因子，對它表達(dá)的調(diào)控可顯著下調(diào)生物膜的形成。c-di-GMP是一種受體廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可協(xié)調(diào)細(xì)菌多種生理過程以利于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化。研究表明c-di-GMP通過調(diào)節(jié)與Ⅲ型菌毛基因簇相鄰的操縱子mrkHIJ影響菌毛的合成，其中MrkI是LuxR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活其自身的操縱子并調(diào)節(jié)Ⅲ型菌毛表達(dá)，MrkH是Ⅲ型菌毛基因簇的核心轉(zhuǎn)錄激活因子，與c-di-GMP結(jié)合正反饋激活Ⅲ型菌毛表達(dá)，是引發(fā)生物膜形成的主要機(jī)制，這使其成為防止生物膜形成的理想靶標(biāo)，而MrkJ通過編碼磷酸二酯酶降解c-di-GMP，從而影響MrkH轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，抑制Ⅲ型菌毛表達(dá)[20]。組蛋白樣核苷結(jié)構(gòu)蛋白H-NS是Ⅲ型菌毛基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)劑，在H-NS缺失的情況下，mrkA基因表達(dá)被抑制，KPN生物膜形成減少了10倍[21]。不同的環(huán)境刺激菌毛的調(diào)控機(jī)制也不同，如可感應(yīng)滲透信號OmpR/EnvZ雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)和含F(xiàn)e-S簇的轉(zhuǎn)錄因子IscR分別在高滲環(huán)境下和含鐵的環(huán)境下通過直接或者間接影響c-di-GMP水平調(diào)控Ⅲ型菌毛的形成[22- 23]；人體內(nèi)的肺表面活性劑磷脂酰膽堿和膽固醇也可誘導(dǎo)mrkA啟動子的轉(zhuǎn)錄提高Ⅲ型菌毛的表達(dá)介導(dǎo)KPN生物膜形成[24]。第二信使環(huán)狀單磷酸腺苷cAMP-cAMP受體蛋白(cyclic AMP receptor protein，CRP)也是全局調(diào)節(jié)蛋白之一，主要參與細(xì)菌的碳代謝物抑制過程，近期研究表明，其也可作用于Ⅰ型和Ⅲ型菌毛調(diào)控機(jī)制介導(dǎo)菌毛表達(dá)[25]，并且在Ⅲ型菌毛的mrk操縱子上游區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了潛在的CRP結(jié)合位點，可正調(diào)控該操縱子的表達(dá)，促進(jìn)Ⅲ型菌毛的合成[26]。菌毛起源于細(xì)菌膜內(nèi)側(cè)基粒上，目前已發(fā)現(xiàn)KPN膜蛋白表達(dá)的完整性對菌毛表達(dá)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起至關(guān)重要的作用，但具體的作用蛋白和調(diào)控靶點還需進(jìn)一步地探索。同時，高效轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-di-GMP和cAMP-CRP均促進(jìn)菌毛形成，二者之間是否有相互作用也可作為未來研究方向以促進(jìn)深入了解菌毛的調(diào)控過程，為有效阻止生物膜形成打下基礎(chǔ)。

多糖在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制細(xì)菌生長產(chǎn)生的多糖主要起保護(hù)、黏附和組成生物膜結(jié)構(gòu)的作用。多糖不僅能包裹在細(xì)菌表面形成多孔支架結(jié)構(gòu)阻止或限制有害分子的滲透，還可以與抗菌肽相互作用，阻止其殺傷細(xì)菌；聚集的多糖促進(jìn)細(xì)菌間和細(xì)菌與介質(zhì)間黏附，有利于細(xì)菌定殖；而且多糖還可以與蛋白質(zhì)等大分子形成網(wǎng)絡(luò)為生物膜提供穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌群落分層并建立濃度梯度[27]。參與KPN生物膜形成與成熟的多糖主要為莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。

CPS在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制：部分臨床分離的KPN會產(chǎn)生一種黏液樣的基質(zhì)包裹在細(xì)菌細(xì)胞壁外層被稱為莢膜。除含有大量的水分外，其組成大多為多糖類物質(zhì)，是K抗原的主要成分。CPS主要通過穩(wěn)定KPN在基質(zhì)上的黏附性于生物膜的初始形成過程中發(fā)揮作用，并且通過調(diào)整細(xì)菌的空間分布規(guī)則進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)菌聚集，促進(jìn)KPN形成具有典型三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜[27- 28]。同時，CPS還可通過降低炎性因子抑制或損傷宿主細(xì)胞的吞噬作用，有效保護(hù)生物膜內(nèi)菌體免受或少受如溶菌酶、補(bǔ)體、抗菌肽等多種殺菌/抑菌物質(zhì)的損傷，使細(xì)菌高效的適應(yīng)環(huán)境變化[29]。多糖分子組成和構(gòu)型的多樣性，使莢膜結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有79種類型的莢膜[30]，其中K1、K2、K20、K57莢膜血清型常與高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，HvKP)相關(guān)[31]。HvKP主要常見于亞洲地區(qū)，因能產(chǎn)生大量CPS，致病性較強(qiáng)，可在健康人群中形成如化膿性肝膿腫、眼內(nèi)炎等嚴(yán)重感染，是社區(qū)醫(yī)院的嚴(yán)重危害菌[2]。研究顯示HvKP與生物膜形成顯著相關(guān)，且K1型HvKP中參與CPS鏈接形成的聚合酶magA基因的高表達(dá)導(dǎo)致HvKP在氣液界面處形成生物膜[32]。同時,高毒力CRKP的產(chǎn)生無疑可能會成為下一個“超級細(xì)菌”，生物膜的形成將加重其危害程度，應(yīng)引起臨床高度重視[33- 34]。

對KPN CPS進(jìn)行分析顯示[30]，cps基因簇負(fù)責(zé)編碼KPN CPS，在cps基因簇的5’端有6個高度保守的基因組(galF、cpsACP、wzi、wza、wzb、wzc)，主要編碼CPS合成轉(zhuǎn)運(yùn)和加工的蛋白質(zhì)；在3’端發(fā)現(xiàn)編碼葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶和UDP-葡萄糖脫氫酶的保守基因，是合成CPS的基礎(chǔ)；而中間區(qū)域(可變區(qū)域)主要包含編碼 CPS 亞基聚合和組裝的基因，如編碼糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)位酶、聚合酶和修飾酶(乙?；D(zhuǎn)移酶、丙酮酰基轉(zhuǎn)移酶等)的基因，因其表達(dá)差異性，導(dǎo)致CPS結(jié)構(gòu)多樣，豐富了K抗原類型[35]。研究顯示莢膜的K抗原血清型的特異性與wzi/wzy基因座的序列高度相關(guān)，對這些基因座進(jìn)行測序可對KPN的K抗原血清型進(jìn)行分型[30，36]，為臨床早期發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重致病菌提供依據(jù)，及時進(jìn)行早期治療。

KPN CPS的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子主要有：CsrB碳源利用系統(tǒng)、RcsAB雙組份系統(tǒng)、rmpA/rmpA2蛋白、KvrB、KvrA、KvgA、KvhA、KvhR和Fur蛋白。其中較為主要的是CsrB碳源利用系統(tǒng)和RcsAB雙組份系統(tǒng)，這些系統(tǒng)本身都受多個基因的調(diào)控：CsrB是碳儲存調(diào)控小RNA，它整合了來自UvrY-Bara二組分系統(tǒng)和各種碳代謝基因的信號，被DksA激活后，促進(jìn)cps基因轉(zhuǎn)錄，提高CPS的產(chǎn)生，可被CsrD靶向降解[37]；RcsAB是一種非典型的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在galF基因啟動子區(qū)域存在RcsAB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特定DNA序列，正向調(diào)節(jié)CPS的產(chǎn)生，rcsAB基因敲除菌株的CPS產(chǎn)生水平和生物膜形成能力均降低。同時，RcsB對CPS合成的調(diào)控也取決于rmpA蛋白的輔助作用[38]。rmpA/rmpA2蛋白通過與cps基因啟動子區(qū)域的靶位結(jié)合正向調(diào)控cps基因的轉(zhuǎn)錄使KPN高表達(dá)CPS，且rmpA/rmpA2蛋白與HvKP菌株高度相關(guān)[39]。在KPN中發(fā)現(xiàn)KvrA和KvrB(與大腸桿菌的SlyA和MprA同源)屬于MarR調(diào)節(jié)蛋白家族，MarR調(diào)節(jié)蛋白家族主要影響細(xì)菌抗生素抗性和莢膜調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。對大腸桿菌研究顯示，SlyA是H-NS的拮抗劑，H-NS可抑制KPN中RcsA表達(dá)，SlyA解除H-NS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默促進(jìn)莢膜合成；MprA是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，影響莢膜的合成[40]。而KPN中KvrA基因和KvrB基因缺失的突變菌株表現(xiàn)出CPS產(chǎn)量的減少，但其是否通過驅(qū)動cps基因的啟動子調(diào)節(jié)莢膜表達(dá)還有待研究[41]。環(huán)境因素也影響莢膜的表達(dá)，研究顯示感應(yīng)環(huán)境中的自由基壓力和缺鐵環(huán)境的KvgA/KvgS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在壓力環(huán)境下，反應(yīng)調(diào)節(jié)因子KvgA通過作用于orf基因激活cps基因的表達(dá)，且KvgA 是 KvhA和KvhR表達(dá)的自動調(diào)節(jié)子和激活子，即：這3個同源應(yīng)答調(diào)節(jié)劑相互協(xié)調(diào)控制莢膜的表達(dá)[42]。當(dāng)KPN生活在富含鐵的環(huán)境中時，莢膜多糖的表達(dá)被降低，這主要是因為Fur蛋白抑制了基因rmpA和RcsA的轉(zhuǎn)錄[43]。碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)可轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化環(huán)境中存在的各種糖以供細(xì)菌生長。在KPN中發(fā)現(xiàn)碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)CPS大量形成導(dǎo)致生物膜形成增加[44]。CPS的高表達(dá)不僅在KPN的免疫殺傷及生物膜形成和成熟過程中發(fā)揮作用，也是HvKP的重要毒力因子可引起嚴(yán)重感染。CPS的調(diào)控除受到環(huán)境中碳源的影響外，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用也是未來需要進(jìn)一步研究的方向。

LPS在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制：LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞膜的主要成分，由脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原組成。KPN生物膜形成過程中LPS參與KPN與非生物表面的初始黏附，研究表明O抗原除作為一個重要的毒力因子可保護(hù)細(xì)菌免受宿主損傷，利于細(xì)菌定植感染，且當(dāng)KPN處在模仿體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境時，CPS和O抗原是生物膜初始聚集體形成的基本物質(zhì)[45]。KPN中LPS和CPS并非完全獨(dú)立地產(chǎn)生，在LPS生物合成中起重要作用的酶也影響KPN CPS的數(shù)量和結(jié)構(gòu)[46]。KPN LPS生物合成和輸出涉及4個不同的基因簇：lpx、waa、rfb、lpt，其中編碼脂多糖O抗原合成的核心基因簇為rfb基因組，主要由wzm、wzt、wbbM、glf、wbbN、wbbO等6個編碼基因組成[47]，其合成由3種類型的酶完成：核苷酸激活糖的生物合成、多糖重復(fù)單元的合成以及重復(fù)單元的組裝和跨膜運(yùn)輸(脂肪酶)，主要依賴于三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑調(diào)控[48- 49]。將LPS的合成機(jī)制作為靶點進(jìn)行攻擊，不僅影響莢膜與生物膜的形成，也可延緩疾病的惡化發(fā)展[47，49]。

脂質(zhì)A作為模式識別受體TLR4的有效配體可被宿主免疫系統(tǒng)識別清除，但KPN通過修飾脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)可逃避免疫系統(tǒng)的殺傷。KPN脂質(zhì)A的生物合成主要由lpx基因編碼產(chǎn)物參與、PhoPQ兩組分系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。脂質(zhì)A在PhoPQ調(diào)節(jié)的加氧酶lpxO和lpxL基因編碼的脂質(zhì)A修飾酶的作用下，可介導(dǎo)KPN對吞噬作用的抵抗性、逃避宿主的先天免疫、保護(hù)KPN免受多黏菌素的侵害[50- 51]。有研究顯示MgrB是一種小的(47個氨基酸)膜結(jié)合肽，是PhoPQ兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，mgrB基因突變使PhoPQ調(diào)控脂質(zhì)A重塑，賦予KPN對多黏菌素和哺乳動物抗菌肽的抗性[52]。另外，lpxL2酶為lpxL基因編碼產(chǎn)物的主要成分，lpxO介導(dǎo)的lpxL2轉(zhuǎn)移肉豆蔻酸酯的羥化作用，主要參與脂質(zhì)A?；饔?，由于lpxL2和lpxO基因的突變，使KPN易受抗菌肽的影響[51]。多黏菌素是治療CRKP感染的有效藥物之一，脂質(zhì)A修飾功能導(dǎo)致KPN對多黏菌素產(chǎn)生耐藥性，因此，對脂質(zhì)A修飾機(jī)制的研究可作為KPN藥物開發(fā)的候選靶標(biāo)。

群體感應(yīng)系統(tǒng)在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制因生物膜形成的動態(tài)性和環(huán)境刺激的變異性，細(xì)菌必須具有快速、廣泛協(xié)調(diào)微生物群體中基因表達(dá)信號的能力，這一過程主要受群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)調(diào)控，QS系統(tǒng)是細(xì)菌群體密度信號的感受系統(tǒng)，細(xì)菌自身通過分泌自誘導(dǎo)信號分子相互溝通，響應(yīng)種群密度的變化調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，以適應(yīng)環(huán)境變化，QS系統(tǒng)在生物膜形成全程發(fā)揮作用[53]。KPN的QS系統(tǒng)主要包括 Ⅰ 型和 Ⅱ 型，分別分泌AI- 1和 AI- 2自誘導(dǎo)信號分子。Ⅰ型QS系統(tǒng)是細(xì)菌種內(nèi)交流的高度特異性系統(tǒng)，其AI- 1信號分子由LuxI基因編碼的酶催化合成，LuxR蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控AI- 1信號分子組成，而Ⅱ型QS系統(tǒng)與Ⅰ型QS系統(tǒng)不同，Ⅱ型QS系統(tǒng)還具有種間交流的功能，即它不僅能使細(xì)菌響應(yīng)自身產(chǎn)生的AI- 2，還可以響應(yīng)其他物種產(chǎn)生的AI- 2[54- 55]。AI- 2信號分子在KPN生物膜形成中起主要作用，不僅促進(jìn)KPN生物膜的形成與成熟，對生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也造成一定的影響，其產(chǎn)生依賴于luxS基因。研究顯示KPN協(xié)調(diào)單個細(xì)菌間分泌的AI- 2濃度達(dá)到閾值時，可觸發(fā)信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CPS、LPS、菌毛等多種基因(如wzm、wbbM、mrkA等)的表達(dá)，啟動生物膜的形成，誘導(dǎo)生物膜成熟；此外，另一研究表明KPN的luxS基因缺失突變株，與野生菌相比，突變株產(chǎn)生的生物膜結(jié)構(gòu)疏松，大菌落的形成減少[55- 56]。同時，QS信號分子也可直接或間接地作用于第二信使如c-di-GMP 和cAMP，將復(fù)雜的環(huán)境信息信號轉(zhuǎn)換為一般細(xì)胞內(nèi)信號，促進(jìn)生物膜形成。對群體淬滅劑和QS抑制劑的研究顯示，通過抑制QS系統(tǒng)的信號分子的表達(dá)，可顯著下調(diào)生物膜的形成與成熟[57- 58]?；贙PN對臨床抗菌藥物的高度耐藥以及生物膜的形成使耐藥情況加劇發(fā)展的現(xiàn)狀，QS在生物膜形成過程中的調(diào)控功能使群體淬滅劑和QS抑制劑被認(rèn)為是開發(fā)新的抗感染藥物有前景的靶標(biāo)。同時，細(xì)菌往往在非理想生存條件下與多個物種混合生長，QS介導(dǎo)的細(xì)菌行為在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化中起中心作用。未來，應(yīng)模擬細(xì)菌自然生態(tài)位，集中研究在細(xì)菌生物膜空間結(jié)構(gòu)和/或非理想條件下細(xì)菌之間的通訊是如何運(yùn)作的，以阻止有害細(xì)菌的群體感應(yīng)，促進(jìn)有益細(xì)菌的群體感應(yīng)。

外排泵在KPN生物膜形成的作用及調(diào)控機(jī)制細(xì)菌細(xì)胞膜中介導(dǎo)主動和被動轉(zhuǎn)運(yùn)的外排泵和孔蛋白可用于溝通菌體內(nèi)外的信息，利于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化。有證據(jù)表明外排泵的產(chǎn)生與生物膜形成有關(guān)，可能的機(jī)制為：外排泵可外排形成多糖和QS系統(tǒng)所需分子；可間接調(diào)控參與生物膜形成的轉(zhuǎn)錄因子；通過影響細(xì)菌和其他表面的黏附促進(jìn)聚集[59]。對外排泵抑制劑的研究顯示，外排泵抑制劑與抗菌藥協(xié)同作用顯著降低KPN生物膜形成[60]。研究顯示多重耐藥KPN外排泵編碼基因的上調(diào)表達(dá)使其生物膜形成能力較敏感株強(qiáng)[61]。同時僅在產(chǎn)生生物膜的泛耐藥KPN中發(fā)現(xiàn)AcrAB外排泵的上調(diào)表達(dá)，外排泵導(dǎo)致的KPN耐藥性與生物膜形成能力顯著正相關(guān)[9]。在CRKP菌株中發(fā)現(xiàn)，VIM- 1與IMP- 1耐藥基因與生物膜形成存在顯著相關(guān)性，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究[62]。而KPN生物膜的形成會上調(diào)acrA、emrB、oqxA、qacEΔ1等外排泵基因的表達(dá)，進(jìn)一步增加細(xì)菌的耐藥性，利于細(xì)菌在抗菌素條件下存活[63]。即，KPN外排泵的表達(dá)與生物膜的形成是相輔相成的，對于抑制細(xì)菌外排泵表達(dá)的因素也會影響生物膜的形成。但對外排泵確切在生物膜形成中的作用的研究較少，沒有直接的證據(jù)表明抑制特定的外排泵會如何影響生物膜的形成。因此，研究高效的外排泵抑制劑與質(zhì)譜法和代謝組學(xué)研究相結(jié)合，確定受抑制影響的同源外排泵底物，可能是發(fā)現(xiàn)外排泵確切作用的一個有效手段。

KPN易形成生物膜，且對臨床分離的CRKP菌株研究顯示其不僅形成生物膜能力較強(qiáng)，且形成生物膜后導(dǎo)致CRKP感染死亡率升高[8，64- 65]，但也有部分研究表明CRKP菌株形成生物膜的能力較弱，可能是因為CRKP菌株缺失了與生物膜形成相關(guān)重要基因的表達(dá)，如調(diào)控菌毛形成的MrkH基因；也發(fā)現(xiàn)CRKP菌株中高黏液型形成生物膜能力較不產(chǎn)黏液型形成生物膜的能力弱，可能是CPS的高表達(dá)覆蓋了菌毛，導(dǎo)致細(xì)菌無法黏附于生物表面，從而生物膜形成減弱[64，66]。在KPN生物膜的形成過程中，細(xì)菌菌毛的表達(dá)直接影響生物膜的初始黏附與形成，同時菌毛可維持CPS流動性使多糖發(fā)揮保護(hù)細(xì)菌免受宿主與環(huán)境作用的殺傷、促進(jìn)細(xì)菌黏附聚集、穩(wěn)定生物膜初始形成的作用，從而形成穩(wěn)固的空間結(jié)構(gòu)促進(jìn)生物膜成熟。細(xì)菌形成初始黏附與聚集后，群落密集系統(tǒng)信號分子通過協(xié)調(diào)菌毛與多糖的表達(dá)，募集空間環(huán)境中細(xì)菌以形成成熟的生物膜。而外排泵與生物膜形成是相輔相成的，在生物膜初始形成中外排泵主要負(fù)責(zé)生物膜形成物質(zhì)的外排，生物膜成熟后則進(jìn)一步促進(jìn)外排泵的表達(dá)利于菌株生存。因此，菌毛的表達(dá)在生物膜形成中發(fā)揮較為重要的作用。

展 望

KPN在全球范圍的流行，尤其CRKP菌株的產(chǎn)生及其耐藥基因的廣泛傳播，對人類健康造成嚴(yán)重威脅。高毒力型KPN和多重耐藥型KPN與生物膜形成顯著的相關(guān)性更是醫(yī)院內(nèi)感染控制的首要目標(biāo)。KPN生物膜的形成過程中菌毛和多糖發(fā)揮初始生物膜形成作用，群落感應(yīng)系統(tǒng)則協(xié)調(diào)二者的表達(dá)以形成成熟生物膜，外排泵的高表達(dá)與生物膜形成相輔相成。目前對KPN生物膜形成及調(diào)控機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)通過抑制菌毛表達(dá)、破壞菌毛結(jié)構(gòu)、攻擊多糖形成及修飾靶點可顯著抑制生物膜的形成，有效控制感染，如MrkH表達(dá)抑制劑、高親和力單價和多價FimH拮抗劑以及作為抗生素研發(fā)靶標(biāo)的脂質(zhì)A合成酶(LpxA、LpxB、LpxC、LpxD)和CPS、LPS合成基因wzm、wzt被廣泛研究，同時還有CPS和LPS疫苗的研發(fā)正在進(jìn)行。但是，KPN多糖成分的異質(zhì)性、糖苷鍵、立體異構(gòu)形式以及參與生物合成和運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)的伴隨變異可能是設(shè)計對抗多種克雷伯菌屬的抗生素和疫苗的一大挑戰(zhàn)。通過抗生素基因測序技術(shù)結(jié)合宏基因組學(xué)方法對KPN臨床菌株進(jìn)行研究將有助于設(shè)計多價疫苗以控制感染。同時發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)可直接或者間接地調(diào)節(jié)c-di-GMP和cAMP-CRP影響菌毛和CPS生成，有大量研究表明c-di-GMP在生物膜形成中的作用，未來可著重研究cAMP-CRP如何影響生物膜形成及與c-di-GMP之間有無相互作用。對群體淬滅劑和QS抑制劑的研究顯示，它們可通過抑制LuxS基因的表達(dá)以減弱AI- 2分子的合成影響生物膜形成與成熟，未來也可將這些物質(zhì)作為抗生物膜形成和預(yù)防控制細(xì)菌感染的新藥進(jìn)行研發(fā)，但這些物質(zhì)對生物膜形成具體的作用機(jī)制以及對人體的影響仍需進(jìn)一步探索，而通過將質(zhì)譜法和代謝組學(xué)研究方法相結(jié)合，可能是一個有效的研發(fā)手段。