大鼠Kruppel樣因子14腺病毒載體的構建及其對心肌細胞肥大的影響

任志磊 楊崇哲 銀孟卓 黃凱華 劉豐

廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院老年病科（廣州510180）

肥胖及脂肪組織與心血管疾病密切相關。作為內(nèi)分泌器官，脂肪組織分泌脂聯(lián)素（adiponectin）、趨化素（chemerin）、瘦素（leptin）等脂肪因子實現(xiàn)與心臟組織的對話。然而各種脂肪因子對心臟的作用并不一致甚至相反［1-3］，因此整體把握脂肪因子網(wǎng)絡對心血管的影響，是探索脂肪內(nèi)分泌途徑治療的前提。

Kruppel樣轉錄因子（kruppel-like factors，KLFs）廣泛參與細胞增殖、凋亡、分化、胚胎發(fā)育及脂肪細胞分化調(diào)控［4］。Kruppel 樣因子14（kruppellikefactor 14，KLF14）屬于KLFs 家族，是脂肪細胞內(nèi)其他基因的“主控調(diào)節(jié)”基因［5］。CIVELEK等［6］和VOIGHT 等［7］證 實KLF14 基因作為遠端基因的“總開關”控制著一系列代謝性特征相關基因的下游基因。然而，KLF14 是否通過整體調(diào)控脂肪因子網(wǎng)絡影響心肌肥厚等心血管疾病目前尚未明確。本研究構建大鼠KLF14 腺病毒表達載體，感染心肌細胞后使KLF14 在心肌細胞內(nèi)過表達，研究KLF14 對心肌細胞肥大的影響，為探索心肌肥厚有效干預靶點提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 質粒、細胞與菌株人胚腎細胞系HEK293細胞、LipofiterTM 轉染試劑從上海漢恒生物公司購買，pHBAd-MCMV-RFP 載體從Hanbio 公司購買，大腸桿菌菌株DH5α從Tiangen 公司購買。

1.1.2 動物與試劑出生1～3 d 的SPF 級SD 大鼠乳鼠購自中山大學實驗動物中心（許可證號SCXK（粵）2011-0029，合格證號：NO.44008500004729）。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶和DNA ladder 從Fermentas 公司購買，質粒抽提試劑盒從康為世紀公司購買，凝膠回收試劑盒從Axygen 公司購買。DMEM、胎牛血清、胰酶從Gibco 公司購買。CCK-8細胞毒性檢測試劑盒從上海貝博公司購買。

1.2 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)用0.06%胰蛋白酶分離出生1～3 d 的SD 大鼠乳鼠心室肌細胞（neonatal rat ventricular myocytes，NRVM）。采用差速貼壁法純化細胞。在最初培養(yǎng)的48 h，在細胞培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L BRDU抑制成纖維細胞增殖，72 h 后用于實驗。用濃度為10 μmol/L 異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）刺激誘導NRVM 建立心肌細胞肥大模型。設立對照組（無菌生理鹽水）及6、12、24、48、72 h 等不同時間的ISO 刺激組。原代培養(yǎng)NRVM，設KLF14 腺病毒（adenovirus-KLF14，Ad-KLF14）組、ISO+Ad-KLF14 組、RFP 腺病毒（adenovirus-red fluorescent protein，Ad-RFP）組、ISO+Ad-RFP 組共4 組，實時定量PCR（real-time PCR，RTPCR）檢測各組KLF14 及B 型鈉尿肽（BNP）mRNA的表達情況。

1.3 KLF14 腺病毒表達載體的構建過程

1.3.1 重組質粒制備根據(jù)在NCBI 查詢到的大鼠KLF14 基因序列人工合成KLF14 基因組片段。用配制好的BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切體系處理pHBAd-MCMV-RFP 載體和KLF14 基因組片段。取2 μL 回收的酶切后KLF14 片段、100 ～200 ng 回收的酶切后pHBAd-MCMV-RFP 載體、1 μL T4 DNA連接酶、2 μL DNA 連接酶緩沖液，加滅菌雙蒸水至20 μL 配成連接液反應體系。該反應體系在16 ℃過夜后即得到pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重組質粒。PCR 鑒定并測序重組質粒，然后通過大腸桿菌大量擴增。

1.3.2 腺病毒載體包裝與純化在293 細胞中把pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重組質粒、pHBAd-BHG骨架質粒包裝成pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒后擴增，收獲腺病毒并測定Ad-RFP和Ad-KLF14 滴度，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 腺病毒滴度測定待培養(yǎng)的HEK293 細胞生長密度約90%時消化細胞，計數(shù)后用含有5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋HEK293 細胞至1 ×105/mL，100 μL/孔加入96 孔板（1 × 104細胞/孔）。將10 μL 病毒上清液按梯度稀釋10 ～106倍，取稀釋后的病毒液依次加到細胞孔中，100 μL/孔，每個病毒準備6 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔更換100 μL 新鮮培養(yǎng)液，72 h 后觀察并計算滴度，滴度（PFU/mL）=表達RFP 陽性細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/病毒體積。

1.4 腺病毒感染心肌細胞流式檢測培養(yǎng)NRVM后換用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入腺病毒，設置對照組（加DMEM 培養(yǎng)基）和感染倍數(shù)（multiplicity of infections，MOI）分別為5、10、20、50、100 梯度組的Ad-KLF14 或Ad-RFP，輕搖細胞培養(yǎng)板混勻，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，置于熒光顯微鏡下拍照。吸取培養(yǎng)基，PBS 洗2 次后用胰酶消化NRVM，NRVM 剛變圓時立即終止消化。離心后用1 mL PBS 重懸NRVM，流式細胞儀檢測NRVM 感染率。

1.5 CCK-8 法檢測不同MOI 腺病毒感染時心肌細胞活力原代培養(yǎng)NRVM，分為以下6 組：對照組（給予DMEM）、Ad-RFP MOI 5 和20 感染組、Ad-KLF14MOI 5、20 和50 感染組，同時設立無細胞的空白孔。每組設定10 個復孔。NRVM 活力（%）=（實驗NRVM 孔OD-空白孔OD）/（對照NRVM 孔OD-空白孔OD）×100%。

1.6 RT-PCR 檢測KLF14 和BNP 表達從各組NRVM 提取RNA行RT-PCR，內(nèi)參GAPDH 引物為5-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 和5-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3；KLF14 引 物 為5-TACCGCAGGAGGCAGATTAC-3 和5-TACGCTGGTGTGACTTGAGG-3；BNP 引物為5-GAGACAAGAGAGAGCAGGACAC-3和5-AAGCAGGAGCAGAATCATCT-3。實驗重復3 次，以Ad-RFP 感染的NRVM 為對照，2-△△Ct法計算各組間相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法使用SPSS 19.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗結果用均數(shù)±標準差表示。多組間比較使用方差分析，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ISO 刺激心肌細胞肥大上調(diào)KLF14 表達用10 μmol/L 的ISO 刺激體外培養(yǎng)NRVM，以無菌生理鹽水處理的NRVM 作陰性對照組，RT-PCR 檢測不同刺激時間點KLF14 的mRNA 表達水平。結果顯示，NRVM 內(nèi)KLF14 在生理狀態(tài)下低豐度表達，ISO刺激30 min時即出現(xiàn)明顯升高，4 h時升高最明顯，隨著刺激時間延長，表達量逐漸恢復至正常低水平，至24 h與對照組差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.2 KLF14 腺病毒載體構建

2.2.1 pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重組載體構建后的酶切鑒定及測序腺病毒骨架及pHBAd-MCMV-RFP 表達載體圖譜見圖2。該表達載體中含有CMV 啟動子調(diào)控的紅色熒光蛋白基因表達。PCR 擴增KLF14 目的基因片段，插入MCMV 啟動子后多克隆位點區(qū)的BamH I/EcoR I 位點，構建表達質粒pHBAd-MCMV-RFP-KLF14。擴增電泳后回收載體膠，pUC57-KLF14 雙酶切結果、KLF14 單克隆PCR 鑒定結果見圖3。經(jīng)上海桑尼生物技術有限公司測序證實插入序列和腺病毒模板質粒100%吻合。和GenBank 已知序列進行BLAST 比對分析證實序列同源性100%相同，說明腺病毒重組質粒構建成功，見圖4。

圖1 ISO 不同刺激時間KLF14mRNA 相對表達水平Fig.1 KLF14 mRNA expression was upregulated in NRVM under ISO stimulation

圖2 腺病毒大骨架和pHBAd-MCMV-RFP 表達載體圖譜Fig.2 The structures of adenovirus vector and pHBAd-MCMV-RFP

圖3 腺病毒構建過程中相關電泳結果Fig.3 The electrophoresis photos of enzyme-digested adenovirus vector

2.2.2 腺病毒滴度測定Ad-RFP 和Ad-KLF14 感染293 細胞得到的第一、二、三代病毒中，均能在熒光顯微鏡下觀察到明顯的紅色熒光，提示構建的腺病毒載體能夠良好的表達KLF14 蛋白。改進的TCID50法計算構建的Ad-RFP滴度2×1010PFU/mL，Ad-KLF14 滴度1×1010PFU/mL。

2.2.3 腺病毒感染心肌細胞MOI 的選擇離體培養(yǎng)的NRVM 培養(yǎng)基中加入腺病毒2 h 后，根據(jù)感染和未感染腺病毒的心肌細胞對光散射率不同，應用流式細胞儀測定心肌細胞感染率，隨著腺病毒MOI 增加，心肌細胞感染率升高，見圖5、6。腺病毒感染心肌細胞后對細胞有一定的毒性作用，CCK-8 檢測結果見圖7。RFP 腺病毒MOI 為5 和20時心肌細胞活力無明顯差異，Ad-KLF14MOI 超過5 時，隨著MOI 的升高，心肌細胞活力逐漸降低。由于Ad-KLF14 感染率較Ad-RFP 感染率低，綜合考慮腺病毒感染心肌細胞的感染率、腺病毒的毒力和心肌細胞活力，后續(xù)實驗選擇感染NRVM 的Ad-KLF14MOI 為20，Ad-RFP 的MOI 為10。

圖4 測序結果對比圖Fig.4 Comparision of sequencing results

圖5 流式細胞儀檢測不同MOI 腺病毒感染心肌細胞感染率Fig.5 The infection rates of NRVM by different MOI of KLF14 or RFP adenovirus detected by FACS

圖6 不同MOI 腺病毒感染心肌細胞感染率直方圖Fig.6 The infection rates of NRVM by different MOI of KLF14 or RFP adenovirus detected by FACS（histogram）

圖7 CCK-8 檢測腺病毒不同MOI 感染心肌細胞時細胞活力比較Fig.7 Comparison of NRVM viability by different MOI KLF14 or RFP adenovirus detected by CCK-8 assay

2.3 KLF14過表達促進ISO誘導的心肌細胞肥大BNP 主要在心室肌中合成，廣泛應用于心力衰竭等心血管疾病的診斷、治療及預后評估，是判斷心肌細胞肥大的重要指標［8-10］。為進一步明確KLF14 在心機細胞內(nèi)高表達對細胞肥大的作用，用Ad-KLF14或Ad-RFP 感染NRVM 后，ISO 刺激細胞產(chǎn)生肥大，以無菌生理鹽水作為空白處理對照，RT-PCR 檢測不同處理組心肌細胞BNP 的表達水平。如圖8 所示，無論是Ad-KLF14 組還是Ad-RFP 組，腺病毒聯(lián)合ISO 組較單純腺病毒組BNP mRNA 都明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；單純感染Ad-KLF14較單純感染Ad-RFP 組BNP mRNA 差異無統(tǒng)計學意義。Ad-KLF14 聯(lián)合ISO 組較Ad-RFP 聯(lián)合ISO 組BNP mRNA明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示KLF14 在心肌細胞內(nèi)過度表達進一步加重細胞肥大。

3 討論

圖8 不同處理組BNP mRNA 相對表達水平直方圖Fig.8 KLF14 overexpression promotes upregulaion of BNP in ISO-induced hypertrophic NRVM

KLF14在心血管疾病中的研究主要集中在動脈粥樣硬化方面［11］。有研究［12］顯示，激活KLF14 可通過調(diào)節(jié)ApoA-I產(chǎn)生減輕動脈粥樣硬化，在急慢性炎癥狀態(tài)下，血管內(nèi)皮KLF14 表達下降，KLF14 可通過抑制NF-κB 信號通路減輕血管炎癥［13］。但WEI 等［14］的研究認為下調(diào)KLF14 表達降低高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-KO小鼠循環(huán)中促炎細胞因子水平，抑制動脈粥樣硬化病變的形成，可能與其調(diào)節(jié)p38mapk 和ERK1/2 信號通路有關。

目前KLF14在心肌肥厚中的研究尚未見報道。心肌肥厚是心臟對慢性壓力或容量超負荷產(chǎn)生的代償反應，見于高血壓心臟病、肺動脈高壓等疾病，其中最常見的是高血壓病引起的左室肥厚（LVH）［15］，心肌細胞肥大是心肌肥厚的基本病理形式。ISO 刺激心肌細胞能較好模擬病理性肥大過程，是目前公認的心肌細胞肥大模型之一。本研究首次發(fā)現(xiàn)，KLF14 在NRVM 中低豐度表達，在病理性肥大NRVM 中表達上調(diào)，提示KLF14 在病理性肥大中可能發(fā)揮作用。由此進一步構建了細胞感染率較高的KLF14 腺病毒載體，首次研究了KLF14 在心肌細胞中的作用，確定KLF14 腺病毒感染NRVM 過表達KLF14 可以促進ISO 誘導的心肌細胞肥大，提示干預KLF14 及其下游通路可能是改善病理性心肌肥厚的潛在治療靶點。但這一作用尚需在整體動物模型上驗證，其相關分子機制亦需進一步深入研究。此外，KLF14 是多種脂肪因子的“主控調(diào)節(jié)”基因，心肌細胞亦可表達甚至分泌多種脂肪因子，KLF14 是否通過調(diào)控脂肪因子網(wǎng)絡影響心肌肥厚等心血管疾病，目前尚不清楚，還需要進一步研究。

綜上，生理情況下，KLF14 在心肌細胞中低豐度表達，KLF14 在ISO 刺激誘導的肥大的NRVM 中表達明顯上調(diào)。本研究成功構建KLF14 腺病毒載體，感染NRVM 后過表達KLF14 促進NRVM 病理性肥大。這一發(fā)現(xiàn)為KLF14 在心肌肥厚中的進一步作用研究提供初步線索和理論基礎，為探索有效干預靶點提供新的思路。