晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和血管內(nèi)皮生長因子蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

毛志方

江西省人民醫(yī)院腫瘤科，江西南昌 330006

非小細(xì)胞肺癌是全世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，近幾十年研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)發(fā)達(dá)及發(fā)展中國家中，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢，5年生存率不足20%，每年新發(fā)的病例數(shù)達(dá)130萬[1-3]。而且非小細(xì)胞肺癌患者在確診時常處于晚期，治療效果較差。因此進(jìn)一步探討非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，對于非小細(xì)胞肺癌的治療具有重要意義。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE） 是一種細(xì)胞免疫球蛋白，主要以兩種形式存在于機(jī)體內(nèi)，可與特異性配體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，促使細(xì)胞的炎癥反應(yīng)加強(qiáng)，引起機(jī)體組織重塑，使肺部發(fā)生病理變化，因此與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進(jìn)血管生成的重要因子，通過促進(jìn)血管新生來滿足腫瘤的指數(shù)生長，并向腫瘤周圍浸潤轉(zhuǎn)移，因此成為多種惡性腫瘤的判定指標(biāo)[7-9]。因此，本研究選取10份非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織作為考察對象，探討非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE 及VEGF 的表達(dá)及相關(guān)性，以期為非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制闡述及臨床治療提供一定的指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2019年12月江西省人民醫(yī)院收治的10例非小細(xì)胞肺癌患者，每例患者僅取1份組織標(biāo)本，共取10份非小細(xì)胞肺癌組織?；颊吣?例，女3例；＜50歲2例，≥50歲8例；腫瘤直徑＜4.0 cm 患者6例，腫瘤直徑≥4.0 cm 患者4例；分化程度：低分化5例，中分化3例，高分化2例。另外收集癌旁正常組織10份（距離腫瘤邊緣5 cm）作為對照。本研究經(jīng)江西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核及同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌，并簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝腎功能異常或者心功能不全者；有精神疾病者；有放化療史者。

1.2 方法

將組織研磨后，按照Trizon 試劑盒提取RNA，采用UV-1600PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）測定mRNA 濃度和純度，后根據(jù)HiFi Script cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在CFX ConnectR實(shí)時熒光定量PCR 儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]上進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，計算出各組RAGE、VEGFa mRNA 的相對表達(dá)量。

操作體系：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture 12.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)程序，三步法。預(yù)變性：95℃、10 min，變性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40個循環(huán)。溶解曲線分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、0.5℃。

RAGE、VEGF-a、β-actin 的引物序列、引物長度、產(chǎn)物長度、退火溫度情況見表1。

表1 不同引物的引物序列、引物長度、產(chǎn)物長度及退火溫度情況

1.3 Realtime PCR 法檢測RAGE、VEGF mRNA 的含量

擴(kuò)增結(jié)果利用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，△△Ct=△Ct 試驗(yàn)-△Ct 對照，△Ct 試驗(yàn)=Ct 目的-Ct 內(nèi)參，△Ct 對照=Ct 目的-Ct 內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者經(jīng)過變量轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計學(xué)分析；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAGE 及VEGF 在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

RAGE mRNA 擴(kuò)增曲線、溶解曲線見圖1，VEGF mRNA 擴(kuò)增曲線、溶解曲線見圖2。

非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE mRNA 的表達(dá)量（0.015±0.009）低于癌旁正常組織（1.000±0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），非小細(xì)胞肺癌組織中VEGF mRNA 的表達(dá)量（4.040±1.650）高于癌旁組織（1.000±0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE 及VEGF 相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE 與VEGF 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.654，P＜0.01）。

圖1 RAGE mRNA 測定結(jié)果

圖2 VEGF mRNA 測定結(jié)果

3 討論

RAGE 是一種細(xì)胞免疫球蛋白，主要以膜結(jié)合形式（mRAGE）和可溶性RAGE（sRAGE）存在于體內(nèi)，主要定位于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞基底膜，另外內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞也均有表達(dá)RAGE[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE 在胚胎發(fā)育期的多種組織中高表達(dá)，成年后在除肺組織以外的其他組織中均低表達(dá)[10-11]。另外有研究表明，在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、血管疾病等疾病中，RAGE 均高表達(dá)[10-11]，而在哮喘、肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、支氣管肺發(fā)育不良、間質(zhì)性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病及肺癌中低表達(dá)[12-13]。有研究結(jié)果顯示，RAGE 在非小細(xì)胞肺癌組織中蛋白及mRNA 表達(dá)量均下調(diào)，而且與腫瘤的TNM 分期、組織學(xué)類型相關(guān)，且過表達(dá)RAGE 可以使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長受限制，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-16]。本研究結(jié)果與以往報道結(jié)果一致[14]在非小細(xì)胞肺癌組織中，RAGE mRNA 表達(dá)量低于癌旁正常組織，提示RAGE 在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程起著抑癌作用，與在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢不同，原因可能在于RAGE 作為正常肺組織細(xì)胞膜上的受體，與肺泡的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、分化及功能密切相關(guān)。RAGE 表達(dá)量的下調(diào)不僅僅干擾了肺泡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，也引發(fā)了肺部腫瘤的形成；也有可能是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞屬于支氣管上皮細(xì)胞，此類型細(xì)胞不表達(dá)RAGE，當(dāng)RAGE 表達(dá)量明顯降低，可能會促進(jìn)此類型細(xì)胞增殖，進(jìn)一步誘導(dǎo)為癌細(xì)胞。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及癌細(xì)胞的生長、凋亡、遷移、侵襲及血管生成等多個復(fù)雜的過程，其中血管生成在腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移過程起著重要作用。血管生成是一個涉及細(xì)胞外基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖等復(fù)雜步驟的過程，整個過程涉及多種生長因子及細(xì)胞因子的調(diào)控作用，VEGF 是目前已知的血管生長因子中最強(qiáng)、特異性最高的一個。VEGF 不僅可以通過特異性結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[17-18]，還可以通過其自身磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解、增加血管通透性進(jìn)而發(fā)揮其促血管生成作用[19-20]。目前針對VEGF 抑制劑的研究已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床研究。本研究Realtime PCR 結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌組織中，VEGF mRNA 表達(dá)量高于癌旁正常組織，與大部分學(xué)者的研究結(jié)果一致[21-22]，說明VEGF 促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。

另外本研究通過Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中的RAGE 與VEGF 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.654，P＜0.01）。RAGE 的DNA 適體能夠降低對G361 裸鼠黑色素瘤8-羥基-2′-脫氧鳥苷、AGEs、RAGE、增殖核抗原、細(xì)胞周期蛋白D1、VEGF、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、CD31 和Mac-3 的水平，RAGE適體通過抑制AGE-RAGE 系統(tǒng)抑制腫瘤血管生成和巨噬細(xì)胞浸潤，從而抑制裸鼠黑色素瘤的生長和肝轉(zhuǎn)移[23]。RAGE 通過激活RAGE/NF-κB 通路誘導(dǎo)人滑膜細(xì)胞VEGF 生成及炎癥反應(yīng)[24]。說明RAGE 可能能夠通過靶向VEGF 影響非小細(xì)胞肺癌的惡性生物學(xué)行為，成為非小細(xì)胞肺癌基因治療的新靶點(diǎn)之一。

綜上所述，RAGE 在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，VEGF 在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，而且非小細(xì)胞肺癌組織中RAGE 與VEGF 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但由于標(biāo)本數(shù)目的限制，目前尚未進(jìn)一步探討RAGE、VEGF 與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，因此本研究未來將對RAGE、VEGF 在肺癌（包括非小細(xì)胞、小細(xì)胞以及其他病理類型）的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系及作用，進(jìn)行進(jìn)一步的探討。