印跡基因GRB10來源的環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334的特征分析及功能預(yù)測

姚文霞 董志杰 潘勁輝 林銘珍 蔡 華 梁 雪

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類不含有5’端帽子和3’端poly A尾巴、由3’端和5’端共價結(jié)合形成的閉合環(huán)形RNA。作為非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)家族的成員，circRNA廣泛存在于各種真核生物中[1]。早期由于科研條件的限制，對circRNA的研究還不夠深入，其被認(rèn)為是RNA剪接過程中的副產(chǎn)物[2]。近年來隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多circRNA被發(fā)現(xiàn)，并被報道是充滿前景的生物標(biāo)記物和治療靶點[3-7]。circRNA具有細(xì)胞特異性表達(dá)[4]、耐受核糖核酸酶R(Ribonuclease R，RNase R)消化[8]等特征，在許多生物過程以及疾病發(fā)生中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。目前報道的主要功能有：充當(dāng)miRNA海綿[8]、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[9]、與RNA結(jié)合蛋白相互作用[10]甚至翻譯成多肽[11]等。

基因印跡是指基因表現(xiàn)出親本等位基因表達(dá)的差異性，即只表達(dá)一方的親本等位基因。生長因子受體結(jié)合蛋白10(Growth factor receptor bound protein 10, GRB10)基因即是典型的印跡基因，其編碼的蛋白是屬于GRB7/GRB10/GRB14家族的銜接蛋白[9]。這些銜接蛋白可識別結(jié)合多個細(xì)胞表面受體及下游信號，從而與其他蛋白產(chǎn)生相互作用并調(diào)控生物學(xué)過程。具體來講，GRB10主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝的調(diào)控，調(diào)控哺乳動物生長發(fā)育、原腸運動和血糖調(diào)節(jié)等[10]。

本文研究的環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334是由GRB10基因經(jīng)反向剪接而成，由轉(zhuǎn)錄本NM_001001555的4、5號外顯子組成。根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫[11]收錄信息，人類GRB10基因可反向剪接形成多個環(huán)狀RNA，其中長度為365 bp的環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334被高通量測序檢測到的相關(guān)研究最多、樣本分布最為廣泛，提示該環(huán)狀RNA具有重要的生物學(xué)功能和意義。因此，本文關(guān)注到了環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334并研究了其基本特征，包括反向剪切位點、RNase R抵抗性和胞質(zhì)胞核分布。另外，通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測該環(huán)狀RNA結(jié)合的miRNA以及miRNA的靶基因，我們構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了靶基因的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)，并對miRNA的靶基因進(jìn)行基因本體論(Gene Oncology, GO)功能富集分析。通過本研究，為深入研究hsa_circ_0008334的特征和功能奠定了基礎(chǔ)，從circRNA-miRNA-mRNA角度為 hsa_circ_0008334的功能研究提供了新的見解，并進(jìn)一步擴充了GRB10基因的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細(xì)胞培養(yǎng)用試劑：DMEM(Gibco)、雙抗(青霉素及鏈霉素)(Gibco)、FBS(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、PBS(Gibco)。RNA提取及RT-PCR用試劑：TRIzol試劑(Invitrogen)、RNase-free H2O(Takara)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, RR047A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara, RR820A)。核酸電泳試劑：DNA marker(Omega, M10-02)、DNA loading buffer(Takara)、SYBR Green I核酸染料(Solarbio, SY1020)。其他試劑：PARIS Kit(AM1921)、RNase R(Epicentre, RNR07250)、RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen, 74204)。引物購自Invitrogen 公司。

1.2 hsa_circ_0008334反向剪接位點的PCR擴增及測序驗證

根據(jù)在circBase(http://www.circbase.org/)[9]上檢索得到的hsa_circ_0008334的序列，設(shè)計一對雙向引物來擴增出包含反向剪接位點的序列，引物序列為：Forward Primer 5’-TGTGCACATCCTCGCTGTCA-3’；Reverse Primer 5’-GGTCCACATCATCCTCTGCT-3’。PCR擴增的模板為細(xì)胞的cDNA， 擴增產(chǎn)物長度為178 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測序。

1.3 RNase R處理實驗

1.3.1 RNA提取 收集細(xì)胞，用Trizol法提出細(xì)胞的總RNA。

1.3.2 RNase R消化 RNase R處理組和對照組(各10 μg RNA)分別加入20 U(2 U/μg)的RNase R和等量的ddH2O，37 ℃孵育10 min。

1.3.3 RNA純化 RNase R處理后的RNA使用RNeasy MinElute Cleanup Kit試劑盒進(jìn)行純化，隨后測定RNA濃度。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將純化后的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系共20 μl：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。

1.4 RNA的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核表達(dá)量分析

1.4.1 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核RNA分離及提取 收集細(xì)胞，用PARIS Kit試劑盒將胞質(zhì)、胞核中的RNA分離并提取出來，隨后進(jìn)行胞質(zhì)和胞核RNA濃度的測定。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR 分別取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA各500 ng，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以該cDNA為模板、用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行實時定量PCR。

1.5 miRNA結(jié)合位點的預(yù)測

利用circBank(www.circbank.cn)[12]和circInteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/[13]兩個在線數(shù)據(jù)庫來預(yù)測環(huán)狀RNA上結(jié)合的miRNA，并取兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集作為環(huán)狀RNA可能靶向結(jié)合的miRNA。

1.6 miRNA靶基因的預(yù)測

利用數(shù)據(jù)庫miTarBase[14]預(yù)測hsa_circ_0008334潛在結(jié)合的五個miRNA的靶基因；miTarBase是一個全面收集已被實驗驗證的miRNA靶標(biāo)的數(shù)據(jù)庫。

1.7 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous，ceRNA)理論，利用Cytoscape3.6.1[15]軟件構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并將其可視化。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點代表不同的RNA分子，連線代表節(jié)點之間的相互作用。

1.8 蛋白交互作用(Protein-protein interactions, PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

靶標(biāo)基因蛋白之間的相互作用，通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，將STRING數(shù)據(jù)庫中的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1[15]軟件繪圖，并將其可視化。每個節(jié)點(Node)代表一個基因，兩點之間的連接也就是邊(Edge)表示交互作用關(guān)系。

1.9 靶基因集合的功能及通路分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[16]數(shù)據(jù)庫中“Functional Annotation Chart”功能模塊對預(yù)測的靶基因集進(jìn)行GO生物學(xué)過程(Biological Process，BP)和分子功能(Molecular Function，MF)分析。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0008334反向剪接位點的PCR擴增及一代測序鑒定

通過PCR擴增hsa_circ_0008334，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示成功擴增出包含反向剪接位點的大小為178 bp的片段(圖1-A)。序列分析表明，hsa_circ_0008334由來源于GRB10基因的轉(zhuǎn)錄本NM_001001555的第5號外顯子反向剪接至第4號外顯子形成，共包含2個外顯子(Exon 4、Exon 5)(圖1-B)；測序結(jié)果進(jìn)一步證實這一結(jié)論，箭頭左端為GRB10基因5號外顯子末端序列，右側(cè)為4號外顯子的起始序列(圖1-B)。

圖1 A. hsa_circ_0008334反向剪接位點的PCR擴增鑒定，擴增片段長度為178 bp；B. hsa_circ_0008334的產(chǎn)生示意圖及反向剪接位點的一代測序峰圖

2.2 hsa_circ_0008334抵抗RNase R消化，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中

環(huán)狀RNA為共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有游離末端，故環(huán)狀RNA對RNase R等RNA核酸外切酶存在一定的抵抗性。為了進(jìn)一步證實hsa_circ_0008334的成環(huán)特性，本研究通過使用RNase R處理細(xì)胞總RNA，然后進(jìn)行RT-qPCR來觀察RNA的降解情況。實驗結(jié)果顯示(圖2-A)：與作為陽性對照的環(huán)狀RNA CDR1as的結(jié)果一致，RNase R處理組的環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334基本沒有降解，相比之下，GAPDH基因的線性mRNA則出現(xiàn)明顯的降解，這表明hsa_circ_0008334耐受RNase R的消化。

由于環(huán)狀RNA的功能與其亞細(xì)胞的定位有關(guān)，因此本研究將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核RNA分離后，用qPCR分別檢測胞質(zhì)、胞核中hsa_circ_0008334的相對分布量。實驗結(jié)果(圖2-B)顯示：對照U1 snRNA主要分布于細(xì)胞核，對照GAPDH主要分布在細(xì)胞質(zhì)，說明胞質(zhì)、胞核RNA分離是成功的；環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334在胞質(zhì)中的表達(dá)量顯著高于細(xì)胞核，即hsa_circ_0008334主要分布于細(xì)胞質(zhì)。

2.3 hsa_circ_0008334上miRNA結(jié)合位點的鑒定

ceRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的主要途徑是通過與miRNA應(yīng)答元件(miRNA response element, MRE)相互結(jié)合。本研究使用在線數(shù)據(jù)庫circInteractome和circBank來分析環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334是否通過ceRNA機制發(fā)揮功能。CircInteractome 數(shù)據(jù)庫顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334上結(jié)合的miRNA數(shù)量為23個(圖3-A)，circBank數(shù)據(jù)庫顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334上結(jié)合的miRNA數(shù)量為46個(圖3-B)。我們將circInteractome和circBank兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集作為hsa_circ_0008334潛在靶向結(jié)合的miRNA，共5個miRNA，即hsa-miR-1265、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-586、hsa-miR-604、hsa-miR-941。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0008334可能通過作為miRNA的ceRNA海綿來發(fā)揮功能。

圖2 A. hsa_circ_0008334抵抗RNase R的消化； B. hsa_circ_0008334、U1 snRNA和GAPDH在胞質(zhì)胞核中的分布情況

圖3 hsa_circ_0008334上MREs位點示意圖。3個環(huán)形均代表環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334的結(jié)構(gòu)模式，由兩個外顯子組成。紅色三角代表通過CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測的hsa_circ_0008334的MRE，藍(lán)色三角和綠色三角分別代表通過circBank中targetscan和miRanda算法預(yù)測的hsa_circ_0008334的MRE

圖4 hsa_circ_0008334-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。紅色長方形代表circRNA，綠色長方形代表miRNA，紫色長方形代表miRNA的靶基因，線條代表不同RNA分子間的連接結(jié)合

2.4 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可視化結(jié)果

環(huán)狀RNA通過與miRNA相互作用后，可調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。我們選取數(shù)據(jù)庫miTarBase預(yù)測hsa_circ_0008334潛在結(jié)合的五個miRNA的靶基因。miTarBase的預(yù)測結(jié)果顯示，hsa-miR-1265、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-586、hsa-miR-604、hsa-miR-94的靶基因數(shù)量分別為72個、24個、94個、39個、55個；去除重復(fù)靶基因之后，上述五個miRNA的靶基因共為279個。通過隨機選取279個靶基因中的39個靶基因，并利用Cytoscape3.6.1軟件，我們構(gòu)建了以hsa_circ_0008334、miRNA以及39個靶基因為核心的circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。圖4形象地展現(xiàn)了它們之間的相互關(guān)聯(lián)。

2.5 靶基因的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)可視化結(jié)果

蛋白之間的相互作用對蛋白行使功能至關(guān)重要。為了評估hsa_circ_0008334下游miRNA對應(yīng)的所有靶基因的功能，我們構(gòu)建了279個靶標(biāo)基因蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。對靶標(biāo)基因蛋白之間的相互作用通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，并利用Cytoscape3.6.1軟件繪圖，得到如圖5所示的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。圖5-A結(jié)果顯示，279個靶標(biāo)基因蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共含有200個節(jié)點和453個邊，即含有200個節(jié)點蛋白和453個交互作用關(guān)系。

關(guān)鍵基因/樞紐基因(Hubgene)是在生物學(xué)過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用的基因，在相關(guān)通路中，其他基因的調(diào)控往往要受到該基因的影響，因此， Hubgene往往是重要的作用靶點和研究熱點。利用Cytoscape中cytoHubba和MCODE兩種算法分析上述PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因(Hubgene)，圖5-B結(jié)果顯示，兩種算法分析得到的前10位排名的Hubgene皆為：ASB6、CDC20、CUL3、FBXW8、FBXL13、FBXL20、KLHL25、SH3RF1、TRIM4、UBE2V1。

2.6 靶基因的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)合集的GO富集及KEGG通路分析

為了評估hsa_circ_0008334潛在結(jié)合的五個miRNA對應(yīng)的所有靶基因的功能，我們通過DAVID在線分析工具對279個靶基因合集進(jìn)行GO功能富集分析。GO分析結(jié)果顯示(圖 6A-6B)，靶基因分別在12個生物學(xué)過程(Biological Process, BP)條目和8個分子功能(Molecular Function, MF)條目中顯著富集。其中最顯著富集的BP條目包括對凋亡、細(xì)胞程序性死亡、代謝過程等的正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控等，最顯著的MF條目包括單鏈RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄抑制因子活性、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性等。

3 討論

本研究首先分別從四個方面成功分析了印跡基因GRB10的新型環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334的特征：hsa_circ_0008334正確成環(huán)，是由GRB10基因第5號外顯子反向剪接至第4號外顯子形成；hsa_circ_0008334能夠抵抗RNase R的消化；hsa_circ_0008334主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。隨后，我們通過生物信息學(xué)方法成功建立了circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，GO功能富集分析表明miRNA的靶基因在對凋亡、細(xì)胞程序性死亡、代謝過程等的正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控的生物過程顯著富集，從circRNA-miRNA-mRNA角度為 hsa_circ_0008334的功能分析提供了新的視角。

圖5 靶基因的蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)(A)及其關(guān)鍵基因(B)：圓形代表節(jié)點蛋白，連線表示交互作用關(guān)系；圓形大小隨相互作用蛋白的個數(shù)增加而增大；連線粗細(xì)隨相互作用的增強而變粗。A. 圓形代表節(jié)點蛋白，連線表示交互作用關(guān)系。B. cytoHubba和MCODE兩種算法分析得出的關(guān)鍵基因

圖6 A. GO富集分析：生物學(xué)過程(Biological Process, BP)；B. GO富集分析：分子功能(Molecular Function, MF)

根據(jù)目前circBase數(shù)據(jù)庫的收錄信息，人類GRB10基因可經(jīng)反向剪接產(chǎn)生大約30個環(huán)狀RNA，其中長度為365 bp的hsa_circ_0008334樣本分布最廣泛，被高通量測序檢測到的相關(guān)研究最多，提示該環(huán)狀RNA功能相對重要，因此本文重點關(guān)注到了hsa_circ_0008334。通過PCR擴增、一代測序?qū)sa_circ_0008334反向剪接位點進(jìn)行驗證，并結(jié)合RNase R處理實驗，證實hsa_circ_0008334正確成環(huán)。將hsa_circ_0008334的序列與基因組序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其由GRB10基因轉(zhuǎn)錄本NM_001001555的2個外顯子(exon4、exon5)經(jīng)反向剪接而成，剪接點前后的序列都分別是AG和GT，符合環(huán)狀RNA產(chǎn)生的剪接規(guī)律[17]。

環(huán)狀RNA的功能與其在細(xì)胞內(nèi)定位密切相關(guān)，位于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀RNA可以與miRNA相結(jié)合，通過充當(dāng)miRNA海綿來發(fā)揮作用。本文在研究環(huán)狀RNA的RNase R抵抗性時，使用的陽性對照CDRIas即是一個行使miRNA海綿體功能的典型例子[18]；環(huán)狀RNA CDR1as包含70多個保守的miR-7結(jié)合位點，可與miR-7吸附結(jié)合，解除miR-7對其靶基因的抑制作用，進(jìn)而提高miR-7靶基因的水平。本研究中，胞質(zhì)胞核分離結(jié)果顯示說明hsa_circ_0008334主要分布于細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核，提示hsa_circ_0008334充當(dāng)miRNA海綿來行使功能。circInteractome 數(shù)據(jù)庫通過targetscan軟件來預(yù)測circRNA上miRNA結(jié)合位點，circBank則利用miRanda和targetscan兩款軟件預(yù)測circRNA和miRNA的相互作用。本研究中，我們分別使用circInteractome 和circBank數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa_circ_0008334的miRNA結(jié)合位點，然后取兩數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集作為hsa_circ_0008334可能靶向結(jié)合的miRNA，即hsa-miR-1265、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-586、hsa-miR-604、hsa-miR-94五個miRNA。miTarBase是一個全面收集已被實驗證實的miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫；本研究通過使用miTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測五個miRNA的靶基因并隨機選取其中39個靶基因后，我們構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)揭示了hsa_circ_0008334可能通過作為hsa-miR-1265、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-586、hsa-miR-604、hsa-miR-94五個miRNA的分子海綿競爭結(jié)合miRNA進(jìn)而影響其下游靶基因的表達(dá)，為hsa_circ_0008334作為ceRNA發(fā)揮功能提供了證據(jù)。

本研究中功能注釋結(jié)果顯示，hsa_circ_0008334潛在結(jié)合的五個miRNA的靶基因在對凋亡、細(xì)胞程序性死亡、代謝過程等的正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控的生物過程顯著富集。hsa_circ_0008334下游靶基因的這些功能與已報道的GRB10基因調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝的調(diào)控等功能相類似，推測hsa_circ_0008334與其母基因GRB10具有部分相似功能。此外，Guo等[19-20]發(fā)現(xiàn)GRB10基因來源的另外一個環(huán)狀RNA circ-GRB10(circBase中收錄號為hsa_circ_ 0080210)參與了椎間盤退行性改變(Intervertebral Disk Degeneration, IDD)的發(fā)生、發(fā)展過程，circ-GRB10作為IDD過程中的關(guān)鍵circRNA具有抑制髓核細(xì)胞凋亡的重要作用，機制上circ-GRB10通過作為miRNA海綿吸附miR-328-5p調(diào)控ERBB2的表達(dá)來發(fā)揮作用。這些研究表明，GRB10基因及其衍生的某些circRNA都調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝等。當(dāng)然，對于GRB10基因衍生的circRNA的功能仍需進(jìn)一步深入研究。此外，作為印跡基因，GRB10表現(xiàn)出親本等位基因差異性表達(dá)；對于GRB10基因衍生的circRNA是否仍表現(xiàn)出親本等位基因表達(dá)的差異性，還需進(jìn)一步研究。

近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對環(huán)狀RNA關(guān)注度的提高，越來越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)功能也被逐漸認(rèn)識。然而，大量的環(huán)狀RNA的功能研究還是空白的。本研究中，我們分析了hsa_circ_0008334的特征，并利用生物信息學(xué)方法成功構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)揭示了hsa_circ_0008334可能通過ceRNA機制發(fā)揮作用；本研究為進(jìn)一步研究環(huán)狀RNA hsa_circ_0008334的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。