身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

吳范武 邵 帥 李繼安 吳晨曦 楊雨旸

華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063210；①河北省中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其并發(fā)癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

身痛逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，方中桃仁、當(dāng)歸、紅花、牛膝、川芎、沒藥、香附活血化瘀，地龍、五靈脂通絡(luò)止痛，羌活、秦艽祛邪利濕，甘草調(diào)和諸藥[1]。王清任認(rèn)為 “氣血通活，何患疾病不除”“所傷者無非氣血”?；诖耍F(xiàn)代許多研究應(yīng)用身痛逐瘀湯以活血祛瘀、通痹止痛，李繼超等[2]發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯治療痰瘀互結(jié)型膝骨關(guān)節(jié)炎療效確切；鐘文龍等[3]發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯能緩解膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛；孫壯等[4]發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯可有效改善瘀血閉阻型膝骨性關(guān)節(jié)炎；向益[5]發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯治療瘀血閉阻型膝骨關(guān)節(jié)炎療效佳；陳國(guó)華[6]發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯能更有效改善關(guān)節(jié)活動(dòng)的受限。以上均可說明身痛逐瘀湯對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有較好療效，但其作用機(jī)制尚不明確。

目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥復(fù)方的研究日趨成熟。它的研究模式并不是對(duì)藥物的簡(jiǎn)單累加，而是以藥物間協(xié)同作用為基礎(chǔ)的整合，符合中醫(yī)整體性與辨證論治的原則。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 方法

1.1有效活性分子的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)[7-8]，收集身痛逐瘀湯各組成藥物的成分信息。依據(jù)口服生物利用度(OB≥30%)、類藥物參數(shù)(DL≥0.18)和半衰期(HL≥4)三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)一步篩選[9-11]，同時(shí)查閱文獻(xiàn)作為補(bǔ)充，最終獲得身痛逐瘀湯的有效活性成分。

1.2藥物潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 結(jié)合PubChem、CancerHSP和DrugBank[12-13]等數(shù)據(jù)庫(kù)，將活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行校正，轉(zhuǎn)換為基因名。

1.3骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的篩選 利用GeneCards、OMIM和Therapeutic Target Database (TTD) 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“osteoarthritis”為關(guān)鍵詞查找骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn) 利用R語言的VennDiagram包，將身痛逐瘀湯活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)同骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比、取交集，獲得身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.5分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將身痛逐瘀湯有效活性成分和預(yù)測(cè)的其抗骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析屬性[14-15]，篩選出身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的主要活性成分及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.6蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 將身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0的“Multiple proteins”功能中，物種(Organism)設(shè)為“Homo sapiens”，最小互作得分(Interaction Score)設(shè)為“Medium Confidence-0.900”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，保存結(jié)果。

1.7基因本體和信號(hào)通路分析 基于R語言，借助Bioconductor的ClusterProfiler、DOSE和Pathview語言包，對(duì)身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)涉及的主要生物過程和信號(hào)通路(P<0.05)，篩選排名前20的生物過程和信號(hào)通路，繪制條形圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1身痛逐瘀湯活性成分篩選 TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到身痛逐瘀湯的1641個(gè)活性分子，按OB≥30%、DL≥0.18和 HL≥4的要求，篩選得到207個(gè)有效活性分子，去重后最終得到180個(gè)活性成分。

2.2身痛逐瘀湯治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP、PubChem、CancerHS、DrugBank等數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找上述180個(gè)活性成分的潛在靶點(diǎn)，剔除重復(fù)后，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配校正，最終獲得462個(gè)藥物靶點(diǎn)。在GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“osteoarthritis”為關(guān)鍵詞查找，共獲得骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)2885個(gè)。將藥物的相關(guān)靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到186個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，見表1；將結(jié)果繪制韋恩圖，見圖1。

表1 身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎潛在作用靶標(biāo)信息列表

圖1 藥物與疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件將180個(gè)活性成分與186個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。其中47個(gè)活性成分因無對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)被剔除，最終網(wǎng)絡(luò)共包括133個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、186個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)及1096條相互作用連線。

圖2 分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

分析顯示，該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的平均度值(Degree)為6.91，平均介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)為0.01。選取度值和介數(shù)中心性均超過平均值的節(jié)點(diǎn)為核心節(jié)點(diǎn)，包括quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黃芩素等19種主要活性成分，見表2；ESR1、AR、PTGS1、PPARG、GSK3B等10個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，見表3。

表2 網(wǎng)絡(luò)核心活性成分信息

表3 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)基因名稱及拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將186個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0，分析蛋白互作關(guān)系，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中連線數(shù)目前20的靶點(diǎn)，繪制條形圖，見圖4。

2.5GO和KEGG富集分析 GO分析得到150個(gè)條目(P<0.05)，主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體配體活性、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體等，見圖5。KEGG 通路富集分析篩選得到137條信號(hào)通路(P<0.05)，主要涉及MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等，見圖6。MAPK信號(hào)通路見圖7。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中30個(gè)連線數(shù)目最多的蛋白質(zhì)

圖5 GO功能富集分析條形圖與氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析條形圖與氣泡圖

圖7 MAPK信號(hào)通路

3 討論

身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)主要有效分子涉及quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黃芩素等。quercetin/槲皮素能降低炎癥因子的表達(dá)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[16]；kaempferol/山柰酚可減輕關(guān)節(jié)軟骨病變，緩解炎性反應(yīng)和神經(jīng)根疼痛[17]；beta-sitosterol/β-谷甾醇能加強(qiáng)成骨作用[18]；Luteolin/木犀草素可促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化等[19]；baicalein/黃芩素能抑制破骨細(xì)胞分化[20]。

身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎的186個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，可推測(cè)出152個(gè)GO條目(P<0.05)，涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體配體活性、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體等。核受體調(diào)控多種生物學(xué)過程，其功能紊亂可導(dǎo)致炎癥[21]。轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥與免疫反應(yīng)，與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病、治療相關(guān)[22]。受體配體解釋了生理和病理過程[23]。類固醇激素在治療骨關(guān)節(jié)炎中也有很大作用。

KEGG通路富集篩選到137條信號(hào)通路(P<0.05)，MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等明顯與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)。MAPK信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎病理改變有關(guān)[24]；激活PI3K/Akt信號(hào)通路可抗骨關(guān)節(jié)炎[25]；NF-kB信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[26]；JAK/STAT信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎病理變化中發(fā)揮作用[27]；Toll樣受體引起的固有免疫是骨關(guān)節(jié)炎的重要環(huán)節(jié)[28]。

因此，身痛逐瘀湯主要通過quercetin/槲皮素、kaempferol/山柰酚、beta-sitosterol/β-谷甾醇、luteolin/木犀草素、baicalein/黃芩素等分子作用于ESR1、AR、PTGS1、PPARG、GSK3B等靶點(diǎn)，進(jìn)而影響核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體配體活性、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體等，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等以抗骨關(guān)節(jié)炎。

綜上，身痛逐瘀湯抗骨關(guān)節(jié)炎是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)的。