間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨病損修復(fù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

陳有榮 顏昕 鄧榮輝 林霖 范寶石，2 楊夢(mèng)，2 江東 余家闊

1 北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100191）

2 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院（山東濰坊261053）

透明軟骨覆蓋于關(guān)節(jié)表面，在承重、吸收力學(xué)震蕩、降低關(guān)節(jié)表面摩擦力等方面起著非常重要的作用。急性創(chuàng)傷及退行性關(guān)節(jié)疾病均可能導(dǎo)致軟骨損傷，由于關(guān)節(jié)軟骨無血管、無神經(jīng)、無淋巴管以及缺乏干細(xì)胞的特征，使其自我修復(fù)潛力非常有限，若不及時(shí)治療，最終將發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）[1]。傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)鏡清理、骨髓刺激（bone marrow stimula?tion，BMS）技術(shù)、自體或同種異體骨軟骨移植、自體軟骨 細(xì) 胞 移 植（autologous chondrocyte implantation，ACI）和金屬等人工材料修復(fù)或替代局部軟骨損傷，存在纖維軟骨再生、供體部位并發(fā)癥、移植物失敗、種子細(xì)胞去分化、替代物松動(dòng)翻修等局限性和不足[2]。近些年來，基于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchmal stem cells，MSCs）的再生醫(yī)學(xué)為軟骨病損提供了一種很有希望的治療策略。MSCs具有組織來源廣泛、較強(qiáng)的増殖和多向分化能力，并避免了倫理方面的限制、致瘤性及定向誘導(dǎo)分化難以掌控等缺點(diǎn)，是軟骨再生領(lǐng)域最有吸引力的細(xì)胞來源之一[3]。目前，MSCs 在多項(xiàng)軟骨修復(fù)的體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中均顯示出較好的療效，越來越多的研究通過客觀準(zhǔn)確的示蹤方法證明MSCs 可在植入?yún)^(qū)增殖、分化及長(zhǎng)期存活，除了直接分化為軟骨細(xì)胞參與組織修復(fù)外，MSCs 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用和旁分泌效應(yīng)亦是其促進(jìn)軟骨再生的重要機(jī)制[4，5]。因此，本文主要就近些年來應(yīng)用于軟骨修復(fù)再生的MSCs 的生物學(xué)特征、常見組織來源、實(shí)際修復(fù)效果、各自優(yōu)缺點(diǎn)、最終去向和轉(zhuǎn)歸及其促軟骨修復(fù)再生機(jī)制等方面的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，并對(duì)其應(yīng)用過程中面臨的挑戰(zhàn)及克服策略進(jìn)行介紹。

1 MSCs的起源及生物學(xué)特征

1966年，F(xiàn)riedenstein 報(bào)道了大鼠骨髓中存在成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群，這些細(xì)胞粘附于組織培養(yǎng)皿表面，形成集落，并認(rèn)為是骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在活體移植時(shí)能夠形成不同的骨骼組織[6]。Caplan 創(chuàng)造了“MSCs”這一術(shù)語，并提出了基于MSCs 的軟骨修復(fù)理念。然而，該術(shù)語并沒有被普遍接受。這是由于該術(shù)語僅能使我們對(duì)MSCs的細(xì)胞起源、表型和調(diào)控有一個(gè)模糊而非精確的理解[7]。Caplan 近年提出有必要改變名稱，但他提出的新術(shù)語“藥物信號(hào)細(xì)胞”可能比先前的術(shù)語更沒有幫助，因此，有關(guān)“MSCs”一詞的使用一直是一個(gè)臨時(shí)解決方案，還需要進(jìn)一步解決[8]。MSCs作為一種非造血干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，廣泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、臍帶、胎盤、肌腱、牙周、外周血等多種組織中[9]。國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（The international soci?ety for cell therapy，ISCT）對(duì)MSCs的鑒定有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[10]：（1）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下細(xì)胞能夠粘附于塑料的組織培養(yǎng)瓶；（2）使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物時(shí)，CD90，CD105 和CD73 的陽(yáng)性表達(dá)率≥95%（CD90+，CD105+，CD73+）；而CD45，CD34，CD14（或CD11b），CD79α（或CD19），HLA-DR（即HLA class II）的陽(yáng)性表達(dá)率≤2%（CD45-，CD34-，CD11b-，CD19-，HLADR-）；（3）在標(biāo)準(zhǔn)的體外分化條件下，細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的能力。除了分化潛能外，在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，MSCs發(fā)揮歸巢作用，積極遷移至缺血或損傷部位，通過分泌大量參與旁分泌活動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)因子，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等，并將其傳遞給宿主，刺激宿主的內(nèi)源性細(xì)胞遷移、增殖、分化和基質(zhì)合成，促進(jìn)血管生成，減少氧化應(yīng)激、促進(jìn)組織修復(fù)[4]。此外，MSCs還參與局部的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，通過抑制T細(xì)胞增殖、樹突狀細(xì)胞的成熟激活及增殖，以及抗體B細(xì)胞的分泌，從而影響巨噬細(xì)胞的極化、抗體分泌細(xì)胞的分化和炎性因子的分泌[5]。

2 用于軟骨修復(fù)的MSCs常見組織來源及療效

MSCs 作為多能祖細(xì)胞具有自我更新和軟骨形成能力，因此被認(rèn)為是軟骨修復(fù)的替代細(xì)胞來源，近些年來的臨床前和臨床試驗(yàn)也表明，MSCs相關(guān)治療是治療軟骨損傷和OA的一種有前景的選擇[3]。雖然骨髓被作為MSCs 傳統(tǒng)上的來源，但隨著細(xì)胞分離技術(shù)的進(jìn)步，MSCs 已經(jīng)可以從脂肪組織、臍帶血、外周血、滑膜、滑液、骨膜、真皮、小梁骨和肌肉等組織中分離出來；這些細(xì)胞在誘導(dǎo)時(shí)具有相似的表型特征，但在增殖和分化方面有不盡相同的趨勢(shì)[9]。

2.1 骨髓來源的MSCs

骨髓來源的MSCs（bone marrow-derived MSCs，BM-MSCs）被最早發(fā)現(xiàn)，得到了廣泛研究，因此也是最具特征性的MSCs。相較于其他組織來源的MSCs，骨髓中MSCs 相對(duì)豐富，收集也相對(duì)容易。BM-MSCs 存在于骨髓的有核細(xì)胞群中，其中大多數(shù)是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs），MSCs 僅占有核細(xì)胞總數(shù)的一小部分（0.001%～0.01%），但MSCs 經(jīng)過體外數(shù)周的培養(yǎng)，其數(shù)量可擴(kuò)增100～10000倍[11]。目前，培養(yǎng)擴(kuò)增的BM-MSCs 已被廣泛用于軟骨修復(fù)再生。Zhang 等構(gòu)建了一種由Ⅰ型膠原酪胺和透明質(zhì)酸酪胺組成的可注射水凝膠體系，與BM-MSCs 復(fù)合后用于SD 大鼠體內(nèi)軟骨修復(fù)，效果明顯[12]。Hernigou 等比較了軟骨下BM-MSCs 注射與全膝關(guān)節(jié)置換（totalkneear?throplasty，TKA）治療膝關(guān)節(jié)OA 的效果，在術(shù)后平均10年的隨訪中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞治療后TKA 的總發(fā)生率為1.19%，與同一患者群體對(duì)側(cè)接受初次TKA進(jìn)行翻修的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)，軟骨下注射BM-MSCs 可明顯緩解關(guān)節(jié)疼痛，延緩或避免TKA[13]。Wong 等進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究，比較有或無BM-MSCs 注射聯(lián)合微骨折、內(nèi)側(cè)楔形撐開、脛骨高位截骨治療軟骨缺損的療效，1年后磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）顯示有BM-MSCs 注射組缺損填充及與周圍組織融合的情況更好，2年后有BM-MSCs 注射組的患者所有臨床結(jié)果更佳[14]。然而，BM-MSCs的樣本獲取需經(jīng)骨髓穿刺，該過程創(chuàng)傷較大，可能發(fā)生供區(qū)并發(fā)癥，反復(fù)取樣時(shí)患者接受度較低。

2.2 脂肪來源的MSCs

脂肪來源的MSCs（adipose tissue-derived MSCs，Ad-MSCs）于1976年通過貼壁法從人脂肪組織中分離出來。由于脂肪組織可以通過成熟、微創(chuàng)的方法簡(jiǎn)單重復(fù)地獲得，同時(shí)，等量抽吸物中脂肪組織的MSCs 數(shù)量大約是骨髓的500 倍，因此，有研究認(rèn)為，相較于BM-MSCs，Ad-MSCs可能更適合在臨床中應(yīng)用[15]。Ad-MSCs 從人脂肪抽吸物的基質(zhì)血管中分離、通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)獲得。一項(xiàng)前瞻性、雙盲、隨機(jī)對(duì)照的Ⅱb期臨床試驗(yàn)評(píng)估了單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射自體Ad-MSCs 治療膝關(guān)節(jié)OA的有效性和安全性，隨訪6個(gè)月發(fā)現(xiàn)注射干細(xì)胞組軟骨缺損無明顯變化，患者功能改善和疼痛緩解令人滿意，無不良事件發(fā)生，而生理鹽水注射組軟骨缺損增加[16]。另一項(xiàng)臨床研究報(bào)道了3 個(gè)Ad-MSCs劑量組（低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組6 名患者）治療老年膝關(guān)節(jié)OA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，患者疼痛和功能明顯改善，軟骨缺損通過透明軟骨修復(fù)，缺損面積減少[17]。然而，有體外實(shí)驗(yàn)表明，盡管通過體外添加生長(zhǎng)因子可以增強(qiáng)Ad-MSCs 的成軟骨分化，但其成軟骨分化潛能低于BM-MSCs[18]，這可能會(huì)限制其在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用。

2.3 滑膜來源的MSCs

滑膜來源的MSCs（synovium-derived MSCs，Sy-MSCs）于2001年從膝關(guān)節(jié)滑膜中分離并鑒定，與脂肪或肌肉等其他組織來源的MSCs相比，Sy-MSCs具有更強(qiáng)的軟骨分化能力[19]。在體外實(shí)驗(yàn)良好結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)行了動(dòng)物及人體研究來評(píng)估Sy-MSCs在體內(nèi)的作用。一項(xiàng)人體研究比較了自體Sy-MSCs和自體軟骨細(xì)胞植入修復(fù)軟骨缺損的效果。在24 個(gè)月的隨訪中，兩組的臨床結(jié)果顯示均有改善。然而，在所有的隨訪間隔中，Sy-MSCs 植入組比軟骨細(xì)胞植入組顯示出更好的功能結(jié)果和膝關(guān)節(jié)損傷及骨關(guān)節(jié)炎結(jié)局主觀評(píng)分（knee injury and osteoarthritis outcome score，KOOS）[20]。另一項(xiàng)研究則對(duì)Sy-MSCs 移植對(duì)體內(nèi)軟骨再生的有效性進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)綜述，大多數(shù)研究報(bào)告Sy-MSCs移植后成功修復(fù)了軟骨，并認(rèn)為Sy-MSCs 移植是治療局灶性軟骨缺損的一種有希望的選擇[21]。雖然大多數(shù)研究的結(jié)果較為樂觀，但滑膜的獲取通常需要采用手術(shù)方式，這不僅增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，同時(shí)增加了相關(guān)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 臍帶華通氏膠來源的MSCs

胎兒和胎盤由富有彈性的臍帶連接，臍帶由兩條臍動(dòng)脈和一條臍靜脈組成，它們都鑲嵌在一種被稱為華通氏膠（Wharton’s Jelly，WJ）、富含黏液蛋白多糖的基質(zhì)中，然后由羊膜覆蓋[22]。1998年，Kobayashi等首次報(bào)道在WJ 中獲得了多能成纖維細(xì)胞樣的MSCs（WJ-MSCs），有研究認(rèn)為，與成體來源的MSCs相比，胎兒來源的MSCs增殖和分化活力更強(qiáng)、免疫抑制能力更高，特別是在臨床中同種異體應(yīng)用時(shí)不容易引起宿主的免疫反應(yīng)，因此可能擁有更佳的治療活性[23]。Liu 等將人WJ-MSCs 與豬軟骨細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合構(gòu)建組織工程軟骨并移植到兔軟骨缺損處，未見免疫排斥反應(yīng)，術(shù)后16個(gè)月時(shí)觀察，可見明顯的透明狀軟骨及軟骨下骨再生，且與鄰近正常軟骨融合，研究還發(fā)現(xiàn)未經(jīng)軟骨誘導(dǎo)分化的WJ-MSCs 比誘導(dǎo)組具有更好的修復(fù)效果[24]。Wu 等將WJ-MSCs 與透明質(zhì)酸水凝膠（hyaluronic ac?id，HA）混合后植入小型豬膝關(guān)節(jié)的全層軟骨缺損區(qū)，12周后大體及組織學(xué)觀察提示缺損區(qū)實(shí)現(xiàn)透明軟骨修復(fù)，國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（International Cartilage Repair Society，ICRS）評(píng)分明顯高于對(duì)照組[25]。盡管WJMSCs 相較于成體來源的MSCs 具有諸多優(yōu)勢(shì)，但并不利于干細(xì)胞的自體移植，增加了疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。

2.5 臍帶血來源的MSCs

人臍帶血（human umbilical cord blood，hUCB）作為治療細(xì)胞的來源有許多優(yōu)點(diǎn)，其體外性質(zhì)避免了使用胚胎源性干細(xì)胞相關(guān)的倫理問題，同時(shí)還可以避免使用其他組織來源時(shí)（如骨髓或脂肪組織）可能出現(xiàn)的供區(qū)部位并發(fā)癥。幾十年來，hUCB一直用于治療血液疾病和造血組織的重建[26]。1994年，Ye 等報(bào)道了來自hUCB 的間充質(zhì)樣細(xì)胞黏附在塑料培養(yǎng)皿上，hUCBMSCs 具有較高的增殖率，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增后其核型穩(wěn)定，較BM-MSCs 更易誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞[27]。一項(xiàng)動(dòng)物研究報(bào)道，hUCB-MSC 移植后缺損區(qū)表現(xiàn)出透明樣軟骨修復(fù)、軟骨下骨重塑并與周圍軟骨融合[28]。另一項(xiàng)研究則報(bào)道了hUCB-MSC 移植作為膝關(guān)節(jié)OA 替代治療方案的可能性。該一/二期臨床試驗(yàn)使用hUCBMSCs和透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合物移植治療膝關(guān)節(jié)OA軟骨缺損，結(jié)果顯示患者疼痛和功能改善，無不良反應(yīng)發(fā)生，并維持7年以上，無明顯惡化。通過組織學(xué)評(píng)價(jià)和MRI 檢測(cè)，觀察到持續(xù)再生的透明樣軟骨[29]。然而，與WJ-MSCs 相似，hUCB-MSCs 主要適用于干細(xì)胞的同種異體移植，可能導(dǎo)致疾病傳播。

2.6 月經(jīng)血來源的MSCs

2007年，Meng 等從月經(jīng)血中分離出MSCs（men?strual blood-derived MSCs，Men-MSCs），并證實(shí)其具有MSCs典型的特征，如自我更新、高增殖潛能及成脂、成骨和成軟骨的多向分化潛能，其分化和增殖能力甚至超過BM-MSCs[30]。盡管Men-MSCs 軟骨形成特性尚未得到廣泛的探索和研究，但與BM-MSCs 相比，部分研究者認(rèn)為月經(jīng)血的采集不需要復(fù)雜的倫理程序或任何侵入性的外科干預(yù)，同一供體可重復(fù)采樣，因此Men-MSCs 更容易獲得，可能是再生醫(yī)學(xué)中（如軟骨修復(fù)再生）的有力候選細(xì)胞[31]。然而，有研究認(rèn)為，Men-MSCs軟骨分化潛能較低，不適合作為軟骨再生的干細(xì)胞群體。例如，一項(xiàng)研究比較了同一捐贈(zèng)者的Men-MSCs 和臍帶WJ-MSCs 以及同一捐贈(zèng)者的Men-MSCs和BM-MSCs 之間的基因表達(dá)情況。他們?cè)贛en-MSCs、WJ-MSCs 和BM-MSCs 中篩選了768 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)與WJ-MSCs和BM-MSCs相比，Men-MSCs中重要的成骨和軟骨基因——骨膜蛋白（periostin，POTSN））和骨硬化癥相關(guān)蛋白1（osteopetrosis associated trans?membrane protein 1，OSTM1）的表達(dá)明顯下調(diào)，這表明Men-MSCs 的成骨和軟骨分化潛能較低[32]。此外，Men-MSCs 還具有取材不方便、取材過程容易污染、對(duì)于男性患者和絕經(jīng)患者不適用等缺點(diǎn)。

2.7 外周血來源的MSCs

Fernández 等于1997年首次報(bào)道了乳腺癌患者經(jīng)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimu?lating factor human recombinant，rhG-CSF）動(dòng)員的外周血中基質(zhì)細(xì)胞的存在[33]。研究者發(fā)現(xiàn)通過血液動(dòng)員技術(shù)可以增加外周血中的祖細(xì)胞含量，并成功分離出外周血來源的MSCs（peripheral blood-derived MSCs，PB-MSCs）[34]。研究證明，PB-MSCs 具備鑒定MSCs 所必備的特性，以及類似于BM-MSCs 的成軟骨分化能力，是一種有效的軟骨修復(fù)治療選擇[35]。Broeckx 等將經(jīng)軟骨誘導(dǎo)的同種異體PB-MSCs 聯(lián)合同種異體血漿作為治療馬掌指關(guān)節(jié)OA 的新療法，與對(duì)照組相比，視覺步態(tài)評(píng)估和足底壓力測(cè)試分析結(jié)果提示干預(yù)組功能顯著改善[36]。Fu等的一個(gè)病例報(bào)告報(bào)道了PB-MSCs用于人體軟骨修復(fù)的結(jié)果。PB-MSCs 來源于一名19 歲患有ICRS四級(jí)軟骨損傷的自由搏擊選手，術(shù)者在移植骨膜瓣下注射自體PB-MSCs 并聯(lián)合髕骨關(guān)節(jié)力線重建，術(shù)后8個(gè)月復(fù)查關(guān)節(jié)鏡顯示缺損表面光滑，經(jīng)過7.5年的隨訪，病人恢復(fù)了競(jìng)技，與術(shù)前相比，IKDC 2000主觀評(píng)分、Lysholm 和Tegner 評(píng)分及CT 和MRI 評(píng)價(jià)均有顯著改善[37]。與其他組織來源的MSCs 相比，PBMSCs具有取樣過程微創(chuàng)、并發(fā)癥少、可反復(fù)取樣、有利于促進(jìn)自體干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但PBMSCs的培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，故在體內(nèi)應(yīng)用的報(bào)道較少。通過進(jìn)一步提高PB-MSCs 的動(dòng)員、分離和純化技術(shù)，縮短培養(yǎng)周期，將極大地推動(dòng)自體PB-MSCs 在臨床中的應(yīng)用。

3 MSCs 在軟骨修復(fù)中的轉(zhuǎn)歸及促軟骨再生機(jī)制

MSCs 作為多能祖細(xì)胞具備成軟骨分化和軟骨形成的能力，大多研究者認(rèn)為其主要通過替換老化/丟失的軟骨細(xì)胞來促進(jìn)軟骨修復(fù)。然而，有關(guān)MSCs移植后的最終去向并未闡明，因此，通過客觀準(zhǔn)確的方法示蹤MSCs 在缺損植入?yún)^(qū)的增殖、分化及存活情況，明確MSCs在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，是干細(xì)胞移植基礎(chǔ)和臨床研究中最關(guān)鍵的問題之一，將能更好地了解干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為及MSCs促進(jìn)軟骨修復(fù)的確切機(jī)制。Numa?ta等使用雙轉(zhuǎn)基因大鼠作為動(dòng)物模型，其中MSCs供體大鼠普遍表達(dá)熱穩(wěn)定的人胎盤堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALPP）而受體大鼠表達(dá)熱敏感型ALPP，將供體大鼠的BM-MSCs 注入股骨滑車局灶性軟骨缺損的受體大鼠關(guān)節(jié)腔，在注射后1個(gè)月，可于缺損區(qū)檢測(cè)到ALPP標(biāo)記的MSCs（5.1%±1.6%），但在注射后2個(gè)月和6 個(gè)月時(shí)缺損區(qū)未能檢測(cè)到移植的干細(xì)胞，盡管MSCs 的數(shù)量隨著時(shí)間的推移而減少，但是MSCs 的注射促進(jìn)了軟骨的再生[38]。Li 等將熒光染料DiD 標(biāo)記的人Ad-MSCs 植入大鼠膝關(guān)節(jié)OA 模型，經(jīng)無創(chuàng)生物熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)，其關(guān)節(jié)內(nèi)熒光信號(hào)可持續(xù)存在10周，并明顯促進(jìn)軟骨修復(fù)再生，同時(shí)人FOXP2基因僅在膝關(guān)節(jié)組織中可以檢測(cè)到，表明Ad-MSCs 在體內(nèi)的生物分布有限，具有安全性和可行性[39]。Feng 等將超順磁氧化鐵粒子（superparamagnetic iron oxide particle，SPIO）標(biāo)記的同種異體Ad-MSCs 植入綿羊膝關(guān)節(jié)OA模型，14周后MRI仍可檢測(cè)到干細(xì)胞的標(biāo)記信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的遠(yuǎn)期示蹤[40]。

盡管以上研究證實(shí)MSCs能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，但Santos等研究發(fā)現(xiàn)，將Qtracke655納米晶標(biāo)記水凝膠包裹的同種異體Sy-MSCs 并植于軟骨缺損區(qū)，7 天后取材，僅有少量標(biāo)記的細(xì)胞附著于病變部位及滑液中，其余大部分細(xì)胞附著于滑膜上，其認(rèn)為MSCs在體內(nèi)除了直接分化為軟骨細(xì)胞參與組織修復(fù)外，還有其他機(jī)制促進(jìn)軟骨再生[41]。目前，越來越多的證據(jù)表明，MSCs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用和旁分泌效應(yīng)亦是促進(jìn)軟骨再生的重要機(jī)制[4，5]。

有研究報(bào)道，MSCs植入患有OA的關(guān)節(jié)后，其分泌的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等因子可直接或間接抑制免疫細(xì)胞，PGE2通過與巨噬細(xì)胞上的EP2 和EP4 受體結(jié)合促進(jìn)免疫抑制因子IL-10的產(chǎn)生，并參與CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)[42]。此外，已有研究表明，MSCs可抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，導(dǎo)致片段刺激吞噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)因子，增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的數(shù)量[43]。MSCs 還通過抑制樹突狀細(xì)胞成熟和降低自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞毒性來調(diào)節(jié)先天免疫[44]。γ-干擾素（interfer?on γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 β，IL-1β）刺激的MSCs上清液可增加巨噬細(xì)胞中精氨酸、吲哚胺2，3-雙加氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygen?ase，IDO）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric ox?ide synthase，iNOS）的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞從促炎表型（M1）向抗炎表型（M2）轉(zhuǎn)化。MSCs還分泌豐富的趨化因子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromalcell-derived factor-1α，SDF-1α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和MCP-2，它們能吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，然后通過趨化作用將這些細(xì)胞招募到損傷和炎癥部位，參與損傷組織的修復(fù)[45]。研究指出，MSCs 分泌的細(xì)胞因子可以靶向滑膜和軟骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)合成代謝因子和分解代謝因子，抑制巨噬細(xì)胞的激活和IL-1β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（transforming growth factor alpha，TGF-α）及其他炎癥因子的分泌，誘導(dǎo)抗炎和成軟骨分子的表達(dá)、促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular ma?trix，ECM）的合成，從而修復(fù)受損的軟骨[46]。Barry 和Murphy認(rèn)為，內(nèi)源性MSCs主要通過充當(dāng)細(xì)胞修復(fù)的儲(chǔ)存庫(kù)或作為免疫調(diào)節(jié)的哨兵來減少炎癥，從而有助于維持健康的組織，但在刺激修復(fù)反應(yīng)方面，MSCs 的旁分泌信號(hào)可能比分化更重要，換句話說，MSCs 并不是專門用來替代受損和丟失的軟骨，而是協(xié)調(diào)和增強(qiáng)這種修復(fù)反應(yīng)[47]。Gelleu等也指出，在移植物抗宿主病小鼠模型中注入MSCs后，會(huì)發(fā)生宿主細(xì)胞毒性T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞誘導(dǎo)的MSCs凋亡，并認(rèn)為移植細(xì)胞的凋亡是宿主免疫抑制所必需的，也是影響臨床結(jié)果的關(guān)鍵步驟。其中，移植的MSCs 是作為激活觸發(fā)器，而MSCs 介導(dǎo)的治療效果則具體依賴于宿主細(xì)胞的活性[48]。在另一項(xiàng)研究中，de Witte 等認(rèn)為，MSCs 輸注后，單核細(xì)胞將其吞噬并發(fā)生表型和功能改變，從而使單核細(xì)胞能夠進(jìn)一步介導(dǎo)MSCs 輸注后的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[49]。這兩項(xiàng)研究解釋了MSCs 輸注體內(nèi)后盡管被迅速清除，但治療反應(yīng)仍然持續(xù)的原因，并提示MSCs 的短暫移植和快速清除可能足以或必然引起治療反應(yīng)。同時(shí)，這兩項(xiàng)研究也強(qiáng)調(diào)了宿主免疫系統(tǒng)細(xì)胞在MSCs觸發(fā)的免疫調(diào)節(jié)過程中所起到的重要作用。

作為旁分泌效應(yīng)中的一種，近些年來，越來越多的研究者認(rèn)為MSCs分泌的外泌體在軟骨損傷和OA治療中發(fā)揮著重要作用，這也為軟骨損傷和OA的無細(xì)胞治療提供了新的前景。外泌體是直徑為30～150 nm的胞外囊泡，本質(zhì)上是多泡小體（multivesicular bodies，MVBs）成熟過程中內(nèi)吞體膜向內(nèi)出芽形成的腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles，ILVs），并通過與細(xì)胞膜融合而分泌[4]。外泌體通常被認(rèn)為是細(xì)胞間的通訊載體，MSCs作為維持組織微環(huán)境的基質(zhì)支持細(xì)胞，質(zhì)譜和微陣列分析顯示，其外泌體攜帶大量復(fù)雜的核酸（mRNA和miRNA）、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并具有調(diào)節(jié)和恢復(fù)ECM穩(wěn)態(tài)的功能[50]。Zhang等證實(shí)人胚胎MSCs（embryonic MSCs，EMSCs）外泌體對(duì)軟骨修復(fù)的作用。在該研究中，成年大鼠股骨遠(yuǎn)端滑車作軟骨缺損模型，12 周后，經(jīng)外泌體處理的缺損表現(xiàn)出完整的軟骨和軟骨下骨修復(fù)，表面為規(guī)整的透明軟骨，且與相鄰軟骨融合良好，ECM 沉積情況與未手術(shù)的對(duì)照組非常相似。相反，經(jīng)PBS 處理的對(duì)側(cè)缺損則表現(xiàn)為纖維軟骨修復(fù)[51]。在膠原酶誘導(dǎo)的OA 小鼠模型中，Cosenza 等發(fā)現(xiàn)來自同種異體BM-MSCs 的外泌體通過避免軟骨和骨的基質(zhì)降解來保護(hù)小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨[52]。盡管目前MSCs 外泌體在軟骨再生中的作用機(jī)制尚未完全闡明，但許多研究表明，MSCs 外泌體中包裝的非編碼RNA，如miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是軟骨再生中一些關(guān)鍵基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有效調(diào)控因子。例如，來自人SMSCs的高表達(dá)miR-140-5p的外泌體在體外通過抑制RalA和激活SOX9來阻斷其他Wnt信號(hào)，并在體內(nèi)調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原蛋白（collagen typeⅠI，COL-2）、聚集蛋白聚糖（aggrencan，AGC）、I 型膠原蛋白（collagen type I，COL-1）的表達(dá)來促進(jìn)軟骨組織再生[53]。體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-92a-3p 過表達(dá)的外泌體通過靶向WNT5A 提高了COL2A1、COL9A1、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）和性別決定相關(guān)基因簇9（SRY-related high-mobilitygroup- box gene 9，SOX9）的表達(dá)水平，降低了COL10A1、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcrip?tion factor 2，RUNX-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinases-13，MMP13）的表達(dá)，從而在體內(nèi)促進(jìn)軟骨形成，抑制軟骨降解。lncRNA-KLF3 反義RNA1（KLF3 Antisense RNA 1，KLF3-AS1）過表達(dá)的MSCs 外泌體通過lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/G 蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合蛋白1（G-protein-coupled recep?tor kinase interacting protein-1，GIT1）軸促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[54]。目前，MSCs 外泌體被廣泛認(rèn)為是介導(dǎo)MSCs 治療效果的主要治療因子之一。外泌體具有良好的耐受性，免疫原性和毒性的風(fēng)險(xiǎn)極小，因此，MSCs 外泌體可能是一種比基于MSCs 細(xì)胞治療更安全、更便宜、更有效的治療軟骨損傷及OA 的方式。但是，如何大規(guī)模獲得純化的外泌體，以及如何提高外泌體的利用效率、生物安全性和治療效果還有待進(jìn)一步探索研究。

4 總結(jié)與展望

MSCs 作為多能祖細(xì)胞具有自我更新和成軟骨分化的能力，其組織來源廣泛，可從骨髓、脂肪、滑膜、臍帶、月經(jīng)血、外周血等多種組織中分離獲得，被認(rèn)為是軟骨修復(fù)的替代細(xì)胞來源[9]。大量實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)表明，基于MSCs的再生醫(yī)學(xué)有利于軟骨損傷處的組織修復(fù)再生、改善退變關(guān)節(jié)的功能、延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[3]。盡管MSCs 可以從多種組織中獲得，但一種理想的種子細(xì)胞應(yīng)具備以下特點(diǎn)：取樣過程創(chuàng)傷小，可通過微創(chuàng)的方式獲得，能反復(fù)取樣，患者認(rèn)可度高，易于培養(yǎng)，利于自體移植，無年齡、性別和倫理限制，無免疫排斥及疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，且在成軟骨分化微環(huán)境下能產(chǎn)生足夠的COL-2、蛋白多糖和其他軟骨ECM 成分。相較于其他組織來源的MSCs，PB-MSCs 具有諸多優(yōu)勢(shì)，除培養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)外，基本能滿足上述要求，是一種較好的體內(nèi)修復(fù)和軟骨再生的種子細(xì)胞。目前，越來越多研究通過客觀準(zhǔn)確的示蹤方法表明，MSCs可在植入?yún)^(qū)增殖、分化及長(zhǎng)期存活，除了直接分化為軟骨細(xì)胞參與組織修復(fù)外，MSCs 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用和旁分泌效應(yīng)通過協(xié)助關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)在軟骨再生中發(fā)揮了重要作用，其中，MSCs 外泌體在關(guān)節(jié)軟骨病損的治療中顯示出巨大潛力，可能是一種比基于MSCs細(xì)胞治療更安全有效的方式。

基于MSCs 的再生醫(yī)學(xué)在成為臨床治療軟骨病損的常規(guī)應(yīng)用前，還有許多問題需要解決，主要包括如下幾個(gè)方面：（1）根據(jù)不同類型、不同嚴(yán)重程度的軟骨損傷，其MSCs的最佳組織來源、標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品的獲得、最佳體外培養(yǎng)條件、儲(chǔ)存和運(yùn)輸、MSCs 輸送至損傷部位的最佳介質(zhì)等還有待進(jìn)一步研究；（2）MSCs 的最佳細(xì)胞劑量、注射次數(shù)和間隔時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)尚不明確；（3）進(jìn)一步研究MSCs 的作用機(jī)制，深入了解MSCs 發(fā)揮作用的分子介質(zhì)；（4）建立MSCs 治療效果和安全性的客觀評(píng)價(jià)體系。隨著對(duì)以上方面的深入研究和明確，MSCs相關(guān)治療在骨科和其他許多學(xué)科中的應(yīng)用前景廣闊，有望成為軟骨病損治療的常規(guī)方法。