m6 A RNA甲基化修飾與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

董曉沛綜述，康小紅審校

0 引 言

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核信使RNA(messenger RNA，mRNA)中最常見的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄修飾，m6A修飾最早于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，因技術(shù)瓶頸，該領(lǐng)域的發(fā)展非常緩慢，2011年，肥胖相關(guān)蛋白(fat-mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)被報(bào)道具有m6A去甲基化酶功能，并證明m6A修飾是動態(tài)可逆的，該領(lǐng)域才得以復(fù)興[1]。迄今為止，科學(xué)家們總結(jié)了m6A的相關(guān)修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(METTL3、METTL14和WTAP組成)、去甲基酶(FTO和ALKBH5)以及相應(yīng)的閱讀器(YTHDF1/2/3，YTHDC1)協(xié)同調(diào)控，并將其依次歸類為“書寫者(writers)”，“擦除者(erasers)”和 “閱讀者(readers)”。m6A修飾幾乎參與mRNA所有的代謝過程，如成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接、翻譯和降解等[2]。近年來大量研究證實(shí)m6A RNA甲基化在哺乳動物中具有重要的生物學(xué)功能，如組織發(fā)育、晝夜節(jié)律、DNA損傷反應(yīng)、性別鑒定和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[2]。本文主要就m6A在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用作一綜述。

1 m6A mRNA甲基化概述

m6A修飾是指在腺甘酸的N6位置上添加一個(gè)甲基基團(tuán)，是進(jìn)化上保守的RNA修飾。研究發(fā)現(xiàn)在mRNA中約有0.1%-0.4%的腺苷酸受到m6A修飾，平均每個(gè)轉(zhuǎn)錄本有2-3個(gè)m6A修飾位點(diǎn)，m6A主要發(fā)生在RRACH序列中(其中R=A或G，H=A，C，或U)，在終止密碼子、3′非翻譯區(qū)(3′ultranslated region，3′UTR)、和內(nèi)部長外顯子聚集[3]，從而影響RNA轉(zhuǎn)錄，加工，翻譯和代謝。m6A修飾受到m6A調(diào)節(jié)酶的控制，其中甲基轉(zhuǎn)移酶作為m6A“書寫者”積極催化這種修飾，而具有脫甲基酶活性的m6A“擦除者”可消除m6A修飾，m6A“閱讀者”識別修飾的殘基并傳達(dá)信息，從而建立高效且有序的m6A調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物主要由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、METTL14和腎母細(xì)胞瘤1-相關(guān)蛋白(Wilm＇s tumor 1-associated protein，WTAP)組成，協(xié)同調(diào)控m6A的分布，METTL3為核心組分，METTL14與METTL3結(jié)合為穩(wěn)定的異二聚體，并通過協(xié)同效應(yīng)催化m6A RNA甲基化，WTAP將METTL3- METTL14復(fù)合物錨定在靶RNA上，并促進(jìn)其在核斑點(diǎn)中的積累，由于WTAP不存在甲基轉(zhuǎn)移酶活性，因此該調(diào)控亞基在功能性m6A甲基化復(fù)合物的前提下發(fā)生作用[4]。KIAA1429和RBM15已被確定為M6A“writer”復(fù)合體的新組成部分，RBM15有助于將復(fù)合物招募到目標(biāo)位點(diǎn)。KIAA1429的分子功能尚不清楚[5]。METTL16是新定義的靶向U6小核RNA(U6 snRNA)的m6A分子，通過在蛋氨酸饑餓時(shí)誘導(dǎo)S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表達(dá)來調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸的穩(wěn)態(tài)[6]。

m6A去甲基化酶包括FTO和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)。FTO最初被證明可調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)，并且與肥胖風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[7]。ALKBH5是FTO的同系物，均屬于Fe(II)和α- 酮戊二酸依賴性AlkB加氧酶家族。在m6A調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，F(xiàn)TO和ALKBH5將m6A修飾的核RNA識別為底物，并催化m6A甲基修飾的去除[8]。

m6A閱讀蛋白可分為三大類：①包含一個(gè)進(jìn)化保守的YTH(YT521-B同源性)結(jié)構(gòu)域的蛋白，該結(jié)構(gòu)域折疊成可直接與m6A結(jié)合的疏水芳香結(jié)構(gòu)，人類基因組含有5種YTH結(jié)構(gòu)域蛋白，分別為YTHDFs亞型中的讀取基因(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)和YTHDCs亞型中的讀取基因(YTHDC1、YTHDC2)，對m6A甲基化mRNA的親和力是未甲基化mRNA的10-50倍[9]。YTHDFs亞型的蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中分布。②包括三種核內(nèi)不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)，hnRNPC、hnRNPG和hnRNPA2B1，“m6A開關(guān)”現(xiàn)象即m6A削弱Watson-Crick堿基對，破壞RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而暴露了單鏈hnRNP結(jié)合基序，這些蛋白通過m6A開關(guān)選擇性地與含有m6A的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合[10]，影響mRNA定位和選擇性剪接。③胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1-3，IGF2BP1-3)通過K同源域識別GG(m6A)C序列，在正常和應(yīng)激條件下以m6A依賴的方式增強(qiáng)其靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯[11]。

2 m6A在腫瘤中的作用

2.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶與腫瘤

2.1.1 METTL3METTL3是RNA N6 -腺苷主要的甲基轉(zhuǎn)移酶，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)，包括mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)中，Cui等[12]通過敲低METTL3來阻礙m6A的富集，造成GSCs的生長增強(qiáng)、自我更新和腫瘤的進(jìn)展。相反，METTL3在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過與3′UTR中的SOX2 mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)m6A修飾，沉默METTL3可抑制SOX2的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對γ輻射的體外敏感性，抑制小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤生長，從而發(fā)揮致癌作用[13]。以上爭議的原因可能與m6A標(biāo)記不同的靶mRNA，癌癥干細(xì)胞的遺傳和非遺傳異質(zhì)性有關(guān)。此外，研究表明METTL3在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[14]、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[15]和多發(fā)性實(shí)體瘤中均顯著上調(diào)，METTL3過表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，敲低或敲除METTL3可顯著減少癌細(xì)胞的增殖和遷移，通過多種機(jī)制影響 m6A 修飾發(fā)揮促癌作用。在胰腺癌細(xì)胞中，METTL3的敲低對細(xì)胞增殖無影響，但會提高細(xì)胞對吉西他濱，5-氟尿嘧啶，順鉑和放射線等抗癌藥物的敏感性[16]。在膀胱癌中，METTL3通過識別DGCR8(Di George cirtical region 8)來加速pri-miR221 /222的加工，成熟的miR221 /222抑制了抑癌基因PTEN的表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤生長[17]；在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)中，上調(diào)METTL3促進(jìn)了Np63的表達(dá)，從而促進(jìn)CSCC細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長[18]。

2.1.2METTL14METTL14作為癌基因或抑癌基因在特定腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，為與m6A修飾甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)腫瘤藥物的研發(fā)提供了思路。①抑癌作用，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中 METTL3一樣，METTL14敲低后促進(jìn)了惡性表型，表現(xiàn)為癌基因(如ADAM19)表達(dá)的上調(diào)和抑癌基因(如 CDKN2A)表達(dá)的下調(diào)[12]。同時(shí)，子宮內(nèi)膜癌中METTL14功能的缺失突變會減弱m6A的甲基化，通過激活A(yù)KT通路增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞增殖和致瘤性[19]。在肝癌組織中m6A修飾被抑制，而METTL14下調(diào)提示無復(fù)發(fā)生存差， METTL14以m6A依賴性方式正向調(diào)節(jié)pri-miRNA126，抑制癌轉(zhuǎn)移[20]。這一結(jié)果與Chen等[14]在原發(fā)性肝癌組織中發(fā)現(xiàn)的m6A顯著升高、METTL3過表達(dá)后通過m6A-YTHDF2依賴性SOCS2 mRNA降解而促進(jìn)肝癌發(fā)生的結(jié)論相反。而爭議可能歸因于復(fù)雜因素，包括用于分類mRNA轉(zhuǎn)錄物的不同閱讀器蛋白質(zhì)，以及不同的腫瘤樣本和m6A檢測方法。②致癌作用，在造血干細(xì)胞和AML細(xì)胞中，METTL14過表達(dá)后發(fā)揮致癌作用，其機(jī)制是通過m6A修飾對MYB和MYC mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的積極調(diào)控[21]。這一結(jié)果與AML中METTL3的影響部分重疊，可用IGF2BPs介導(dǎo)的替代閱讀過程來解釋。

2.1.3WTAP在肝癌[22]癌組織中，WTAP過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。但是，WTAP對細(xì)胞增殖的調(diào)控具有細(xì)胞類型特異性。在AML中，WTAP支持腫瘤生長，但阻止白血病細(xì)胞分化[23]。當(dāng)WTAP耗竭后，采用依托泊苷治療可使急性髓性白血病干細(xì)胞凋亡程度明顯增加[23]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，碳酸酐酶IV通過靶向WTAP- WT1- TBL1軸抑制Wnt信號通路[24]。綜上，WTAP在癌癥的治療中可起到重要的作用，但對其分子機(jī)制的了解并不深入，需要進(jìn)一步研究。

2.1.4METTL16METTL16是新定義的m6A的“書寫者”，關(guān)于其在腫瘤中的作用機(jī)制研究相對較少。最近Liu等[25]使用TCGA、GEO和HPA數(shù)據(jù)庫以及組織芯片(TMA)隊(duì)列驗(yàn)證了METTL16在結(jié)腸腺癌中高表達(dá)，且METTL16表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，但其分子機(jī)制并不清楚。

2.1.5KIAA1429在乳腺癌組織中，KIAA1429通過m6A獨(dú)立的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而5′-氟尿嘧啶對降低乳腺癌KIAA1429和CDK1的表達(dá)非常有效[26]。Cheng等[27]研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429在肝癌細(xì)胞過表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲，KIAA1429的下調(diào)抑制了DNA 結(jié)合抑制因子2 mRNA的m6A修飾。以上研究均證實(shí)了KIAA1429在腫瘤中的致癌作用，并發(fā)現(xiàn)了KIAA1429的有效抑制劑，說明KIAA1429可能是一種有前途的腫瘤治療靶向因子。

2.2m6A去甲基化酶與腫瘤

2.2.1 FTOFTO作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和化療耐藥中起著重要作用。Li等[28]發(fā)現(xiàn)FTO在AML中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，F(xiàn)TO通過抑制一組關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本(如ASB2和RARA)的表達(dá)來發(fā)揮其致癌作用，從而抑制全反式維甲酸誘導(dǎo)的t(15；17)AML細(xì)胞向粒細(xì)胞分化。因此，利用靶向的FTO信號抑制因子結(jié)合全反式維甲酸治療白血病可能成為一種有效的治療策略。FTO是R-2-羥基戊二酸鹽(R-2HG)的直接靶點(diǎn)，Su等[29]發(fā)現(xiàn)R-2HG通過抑制FTO而促進(jìn)m6A在MYC和CEBPA轉(zhuǎn)錄本上的積累，降低其mRNA的穩(wěn)定和表達(dá)，抑制AML進(jìn)展。同時(shí)，R-2HG與地西他濱、柔紅霉素等一線化療藥物也有協(xié)同作用，并在小鼠模型中得到驗(yàn)證。Cui等[12]研究表明，F(xiàn)TO在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有促癌作用，其抑制劑MA2是甲氯滅酸(MA)的乙酯形式，可增加GSCs中的mRNA m6A修飾水平，抑制GSC的生長。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO促進(jìn)黑素瘤的致瘤性和抗程序性死亡受體1(anti-PD-1)阻斷的反應(yīng)。FTO敲低增加了致癌基因(包括PD-1，CXC趨化因子基序受體4和SOX10)的m6A甲基化，導(dǎo)致通過閱讀器YTHDF2引起的RNA衰減增加。FTO敲低亦可降低黑色素瘤對γ干擾素的敏感性，進(jìn)而對小鼠的抗PD-1治療產(chǎn)生敏感性[30]。以上均說明了FTO的致癌作用，然而作為抑癌因素，F(xiàn)TO的蛋白水平在肝內(nèi)膽管癌中下調(diào)并降低細(xì)胞凋亡，對順鉑治療產(chǎn)生耐藥性[31]。在透明細(xì)胞腎癌中，F(xiàn)TO的mRNA水平降低與腎切除術(shù)后總生存率降低有關(guān)[32]。

綜上所述，F(xiàn)TO在腫瘤中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。FTO抑制劑(大黃酸、2OG類似物、恩他卡朋、FB23-2、MA2、R-2HG)的發(fā)現(xiàn)預(yù)示了FTO可能成為腫瘤治療和藥物開發(fā)的潛在分子靶點(diǎn)，但其抑制劑在人體內(nèi)的藥物作用還需要被深入證實(shí)。

2.2.2ALKBH5與BRCA突變的上皮性卵巢癌中的FTO相似，ALKBH5的表達(dá)也受到抑制，通過穩(wěn)定FZD10 mRNA激活Wnt /β-catenin途徑，使細(xì)胞對奧拉帕尼(Olaparib)產(chǎn)生抗性[24]。ALKBH2為ALKBH蛋白質(zhì)家族中的一個(gè)亞型，用其構(gòu)建的RNAi慢病毒載體為進(jìn)一步研究ALKBH2沉默后相關(guān)的泌尿系腫瘤生物學(xué)功能的影響提供穩(wěn)定、高效、可靠的技術(shù)平臺[33]。ALKBH5發(fā)揮致癌作用，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中[34]，ALKBH5高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞功能，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。新近研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5可特異性的促進(jìn)AML的進(jìn)展以及白血病干細(xì)胞的自我更新，而對正常造血及血液細(xì)胞的自我更新影響很小[35]。在胰腺癌中，ALKBH5則發(fā)揮抑癌作用，ALKBH5造成lncRNA KCNK15-AS1脫甲基化，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[36]。

2.3m6A結(jié)合蛋白與腫瘤

2.3.1 YTHDF1在人結(jié)腸癌組織中，c-Myc癌蛋白可促進(jìn)YTHDF1基因表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖并對氟尿嘧啶和奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性[37]。YTHDF1可識別溶酶體蛋白酶m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本，并促進(jìn)抗原的降解，被吞噬的新抗原的交叉呈遞和CD8+T細(xì)胞的交叉表達(dá)被抑制，從而導(dǎo)致免疫逃逸和腫瘤的不完全消除[38]。在眼黑色素瘤中，YTHDF1促進(jìn)了含有m6A的HINT2 mRNA(一種腫瘤抑制劑)的翻譯[39]。在NSCLC中，常氧條件下，YTHDF1的耗竭會導(dǎo)致m6A標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物翻譯效率降低，抑制腫瘤的生長并導(dǎo)致癌細(xì)胞對順鉑耐藥；在化療應(yīng)激條件下，YTHDF1 耗竭會導(dǎo)致 m6A修飾的Keap1的翻譯減少，從而上調(diào)Nrf2和AKR1C1(活性氧的清除系統(tǒng))[40]。這些相反的結(jié)果突出了在正常和應(yīng)激狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)YTHDF1表達(dá)及其目標(biāo)穩(wěn)態(tài)的重要性。

2.3.2YTHDF2在HCC中，YTHDF2減少可引起炎癥和血管重建，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。此外，應(yīng)用靶向HIF-2α并恢復(fù)YTHDF2表達(dá)的小分子抑制劑PT2385，可提高體內(nèi)外治療HCC細(xì)胞的效果[41]。Chen等[42]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌臨床樣本中，YTHDF2表達(dá)上調(diào)，YTHDF2通過破壞酵母相關(guān)蛋白mRNA的穩(wěn)定，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系的增殖并抑制其遷移和侵襲，這一現(xiàn)象被稱為胰腺癌細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的“遷移-增殖二分法”。在前列腺癌中，miR-493-3p誘導(dǎo)YTHDF2表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移[43]。Paris等[44]報(bào)道YTHDF2縮短了m6A修飾的TNF受體2(TNFR2)mRNA的半衰期，而后者通常阻止白血病細(xì)胞的積聚，從而促進(jìn)AML的擴(kuò)散。以YTHDF2為靶點(diǎn)不僅能根除白血病干細(xì)胞，還能擴(kuò)增造血干細(xì)胞以增強(qiáng)骨髓重建。因此，YTHDF2抑制劑在AML中的治療前景將非常可觀。

2.3.3YTHDF3LncRNA GAS5增強(qiáng)YAP磷酸化、泛素化和降解，削弱YAP信號，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，而YTHDF3識別m6A修飾的GAS5并誘導(dǎo)其衰變[45]。不同睪丸生殖細(xì)胞瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)亞型間m6A豐度和VIRMA/YTHDF3表達(dá)存在差異，在精原細(xì)胞瘤中，YTHDF3和VIRMA的表達(dá)均上調(diào)，它們之間存在正相關(guān)[46]。這一發(fā)現(xiàn)為鑒別TGCT亞型提供了新思路。

2.3.4YTHDCs結(jié)合蛋白(YTHDC1、YTHDC2)與腫瘤關(guān)系的研究非常少，最近幾年進(jìn)展緩慢。YTHDC1 的異常表達(dá)可調(diào)節(jié)癌組織選擇性剪接[47]。在結(jié)腸癌組織中，YTHDC2 的表達(dá)與腫瘤的分期呈正相關(guān)[48]。YTHDC2通過解開編碼轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α和Twist1的mRNA的5′-UTR而促進(jìn)兩者的翻譯，HIF-1α通過Twist1促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.3.5IGF2BPIGF2BPs在正常和應(yīng)激條件下均可增強(qiáng) mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，這會導(dǎo)致MYC等致癌產(chǎn)物的積累，在宮頸癌和肝癌細(xì)胞中敲除IGF2BP可抑制細(xì)胞的增殖和侵襲[49]。IGF2BP1以m6A依賴性方式破壞卵巢癌和肺癌中miRNA定向的miRNA降解并維持血清反應(yīng)因子的表達(dá)，最終上調(diào)致癌驅(qū)動因子PDLIM7和FOXK1的表達(dá)[50]。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中，螯合物1/ SQSTM1 / p62(p62)的表達(dá)較高，與患者不良預(yù)后相關(guān)。p62通過與IGF2BP1相互作用增強(qiáng)FERMT2和其他促轉(zhuǎn)移因子的穩(wěn)定性[51]。IGF2BP2可介導(dǎo)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上，circNSUN2的m6A修飾被YTHDC1識別，在細(xì)胞質(zhì)中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2三元復(fù)合物，促進(jìn)HMGA2 mRNA穩(wěn)定性[52]。IGF2BP3具有致癌特征，在胰腺癌中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后有關(guān)[53]。

3 結(jié) 語

m6A修飾的“書寫者”，“擦除者”和“閱讀者”在調(diào)節(jié)RNA代謝、干細(xì)胞自我更新、免疫應(yīng)答和各種癌癥轉(zhuǎn)移方面都起到重要作用。毫無疑問，m6A甲基化在開發(fā)全新的人類癌癥療法方面具有巨大潛力。但仍然存在許多挑戰(zhàn)。第一：m6A調(diào)節(jié)劑在某些癌癥中的機(jī)制尚不清楚，尤其是m6A修飾的“閱讀者”相關(guān)研究更少；第二：許多研究表明，m6A調(diào)節(jié)劑和相關(guān)途徑可以用作治療靶標(biāo)，但是在臨床實(shí)踐中由于樣本量大，缺乏特定的應(yīng)用，而且相應(yīng)的副作用在很大程度上還不清楚；第三：m6A修飾蛋白具有抑癌或致癌的雙重作用，許多爭議性的研究結(jié)果有待進(jìn)一步探索其具體原因。當(dāng)然，在下一代測序的時(shí)代，輕松生成和分析大數(shù)據(jù)(組學(xué))是可能的，這將進(jìn)一步擴(kuò)展和變革癌癥生物學(xué)，為解決以上問題提供條件。