弓形蟲弱毒疫苗的研究進(jìn)展

張海生，馬元元，謝世臣，梁勤立，朱興全，王金磊

剛地弓形蟲簡稱弓形蟲，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會性致病原蟲，可感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血動物；全世界約有30%的人感染，我國人群感染率約為5%～20%[1-2]。弓形蟲病給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，使人類健康受到嚴(yán)重威脅。由于弓形蟲生活史復(fù)雜、宿主廣泛、發(fā)育時期多且各發(fā)育期抗原成分特異性顯著，致病、免疫機(jī)制復(fù)雜，至今無有效的抗弓形蟲病藥物和理想的防治方法。人類感染弓形蟲的主要途徑是通過食源性感染，如食用加工不熟的肉類和不干凈的果蔬等，弓形蟲包括不同基因型的蟲株，例如傳統(tǒng)的Ⅰ型(ToxoDB#10)、II型(ToxoDB#1)和III型(ToxoDB#2)蟲株[3-5]。由于弓形蟲廣泛的宿主范圍以及在動物和人群導(dǎo)致的高感染率，疫苗免疫是預(yù)防人和動物弓形蟲病的重要策略。雖然科研人員研究了針對弓形蟲的多種傳統(tǒng)疫苗，例如滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、核酸疫苗、重組蛋白疫苗等，但是各有其缺陷，對動物的免疫保護(hù)力不強(qiáng)。目前效果最好的是弱毒疫苗，例如自然或人為篩選的S48、T263、TS-4等，其中S48已制成弓形蟲Toxovax 疫苗[6-8]。用傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)已構(gòu)建多株弱毒蟲株，具有較好的免疫保護(hù)作用。通過CRISPR-Cas9在弓形蟲研究中的成功應(yīng)用，已構(gòu)建了多株具有良好免疫保護(hù)作用的弱毒疫苗。本文綜述弓形蟲弱毒疫苗的研究進(jìn)展和發(fā)展前景，旨在為弓形蟲疫苗的后續(xù)研究提供參考。

1 弓形蟲傳統(tǒng)弱毒疫苗

TS-4蟲株是由弓形蟲RH株通過化學(xué)突變后獲得，該蟲株可有效防止組織包囊的形成，可部分預(yù)防先天性弓形蟲感染并提高急性感染的存活率[11]。TS-4蟲株雖在豬模型中以及在免疫力強(qiáng)的靈長類動物體內(nèi)安全使用，可作為很有希望的疫苗株，但它的安全性有待進(jìn)一步評價。

弓形蟲T263蟲株由自然突變而來，給貓接種T263蟲株速殖子后，當(dāng)弓形蟲感染貓時，可成功阻止84%的貓排出卵囊[11-13]。但由于該蟲株不能完全阻止貓卵囊的排出，以及考慮到安全性問題，該疫苗株并未商業(yè)化[11-12]。

2 弓形蟲傳統(tǒng)基因編輯疫苗

弓形蟲傳統(tǒng)基因編輯疫苗是通過傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)如鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術(shù)等構(gòu)建弓形蟲基因敲除株，成為弱毒疫苗株，例如RHΔMIC1-3、PruΔOMPDC、RHΔCPS1-1等。RHΔMIC1-3是弓形蟲Ⅰ型RH株的MIC1和MIC3基因雙敲除后所構(gòu)建的弱毒株，MIC1可形成弓形蟲粘附所需的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合乳糖；MIC3則形成表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域和1個凝集素樣結(jié)構(gòu)域[14-16]。弓形蟲的MIC1和MIC3這兩個基因同時敲除之后不僅影響弓形蟲的粘附和入侵，還影響弓形蟲的毒力[14]。如果單獨(dú)敲除MIC1或MIC3基因則對弓形蟲毒力只是微弱的減弱，當(dāng)對MIC1和MIC3基因雙敲除時弓形蟲的毒力明顯降低[15]。RHΔMIC1-3在小鼠體內(nèi)對先天性弓形蟲感染具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，且可有效阻斷弓形蟲的垂直傳播，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答[15]。除小鼠外，RHΔMIC1-3還可使綿羊產(chǎn)生有效持久的免疫保護(hù)力，免疫接種懷孕綿羊時雖然具有輕微的發(fā)熱現(xiàn)象但是不具有感染性；用105個RHΔMIC1-3速殖子接種雌性綿羊可以有效防止綿羊流產(chǎn)，并且減少母羊所產(chǎn)羔羊組織包囊的數(shù)量[10]。有趣的是，RHΔMIC1-3接種貓后并不會在貓體內(nèi)繁殖，它可使貓體內(nèi)產(chǎn)生抗體，但該抗體并不能阻止野生株在貓體內(nèi)的繁殖，這表示RHΔMIC1-3具有宿主特異性[16]。

尿嘧啶是弓形蟲繁殖和毒力形成所必需的，弓形蟲具有完整從頭合成尿嘧啶的途徑[17-18]。脫羧酶(OMPDC)和氨甲酰磷酸合成酶II(CPSII)是弓形蟲從頭合成尿嘧啶途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，這兩種酶由OMPDC基因和CPS基因所決定[17-19]。敲除OMPDC基因或CPS基因均會形成尿嘧啶缺陷型蟲株。PruΔOMPDC是在弓形蟲II型Pru蟲株上敲除OMPDC基因所得到的毒力完全減弱的不可逆蟲株。OMPDC基因的敲除使蟲株繁殖能力喪失、毒力完全減弱、喪失形成包囊和慢性感染的能力[18]。PruΔOMPDC可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞因子CD8+的含量明顯急劇增加，接種小鼠后可預(yù)防弓形蟲I型和II型蟲株的急性感染，并可大幅度降低II蟲株感染后形成包囊的能力[19]。

RHΔCPS1-1蟲株也是由弓形蟲強(qiáng)毒株RH改造構(gòu)建而成的，接種RHΔCPS1-1速殖子可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生長期的保護(hù)性免疫力，能有效防止弓形蟲RH株的感染[20]。RHΔCPS1-1蟲株還可有效延長被弓形蟲慢性感染小鼠的存活時間，提高弓形蟲急性感染的小鼠的存活率，還可減少組織包囊的數(shù)量并阻止弓形蟲向腦內(nèi)移行[21-22]。

3 CRISPR-Cas9基因編輯疫苗

2014年Shen B等人首次成功實現(xiàn)CRISPR-Cas9技術(shù)對弓形蟲的基因編輯操作[23]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于弓形蟲大規(guī)模、高通量和任意基因的基因編輯操作。相對于傳統(tǒng)基因編輯方法的局限性，它不僅成本低、操作簡單、更精確和更高效，有效地解決了弓形蟲基因操作復(fù)雜的問題，并且可快速構(gòu)建基因缺失蟲株[24]。CRISPR-Cas9技術(shù)主要用于弓形蟲的生物學(xué)研究、抗弓形蟲藥物和疫苗的研發(fā)、弓形蟲基因的鑒定和篩選，尤其是CRISPR-Cas9可快速鑒定和敲除弓形蟲的毒力基因。目前，通過CRISPR-Cas9技術(shù)所構(gòu)建的候選弱毒疫苗株主要有RHΔGRA17、PRUΔCDPK2、RHΔTKL1、RHΔNPT1、ME49ΔLHD、RHΔMORN1、ME49-ΔADSL等。

3.1RHΔGRA17弱毒株 RHΔGRA17弱毒株是弓形蟲RH蟲株的GRA17基因缺失的弱毒蟲株。GRA17基因是具有潛在免疫原性的毒力基因，它可以調(diào)控弓形蟲納蟲泡的穩(wěn)定性并與營養(yǎng)攝取有關(guān)[25]。GRA17蛋白位于納蟲泡膜上，決定了其膜的通透性，若GRA17過表達(dá)則會加快弓形蟲的生長速度[26]。用5×104個RHΔGRA17速殖子免疫小鼠，可以對弓形蟲急性、慢性和先天性感染均產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用[27]。RHΔGRA17引起小鼠體內(nèi)強(qiáng)烈的Th1和Th2反應(yīng)，在先天性感染中使仔鼠的成活率和體重都有顯著的提高[27]。

3.2PRUΔCDPK2 弱毒株CDPK2基因是弓形蟲鈣依賴性蛋白激酶家族的一員，CDPK2在調(diào)節(jié)支鏈淀粉的形成和降解中起著關(guān)鍵作用[28]。弓形蟲以支鏈淀粉的形式儲存能量，支鏈淀粉轉(zhuǎn)化所需酶的磷酸化是依賴于CDPK2，CDPK2的活性由Ca2+信號調(diào)節(jié)[28]，所以CDPK2將Ca2+信號與弓形蟲內(nèi)支鏈淀粉的降解聯(lián)系了起來。若CDPK2被破壞，支鏈淀粉在弓形蟲體內(nèi)會大量聚集[29]。此外CDPK2與弓形蟲緩殖子的形成有關(guān)，CDPK2基因的缺失可導(dǎo)致緩殖子期的超微結(jié)構(gòu)改變和活性喪失[29]。PRUΔCDPK2免疫后小鼠主要產(chǎn)生的是Th1型免疫應(yīng)答，可在高劑量的弓形蟲RH株攻擊下延長小鼠存活時間[29]。PRUΔCDPK2在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫保護(hù)應(yīng)答，是潛在的弓形蟲弱毒疫苗蟲株。

3.3RHΔTKL1弱毒株 RHΔTKL1是由弓形蟲RH株敲除TKL1基因所構(gòu)建的。TKL1基因與弓形蟲的粘附作用和毒力有關(guān)，當(dāng)TKL1基因被敲除后弓形蟲對小鼠的毒力就會喪失，所以TKL1是潛在的毒力基因[30]。使用1×106個弓形蟲RHΔTKL1速殖子接種小鼠，可對急性、慢性和先天性弓形蟲病具有顯著的保護(hù)作用，并且被RHΔTKL1免疫的小鼠死亡率和胎兒流產(chǎn)率均大幅度降低，所以弓形蟲RHΔTKL1是一種有前途的候選弱毒疫苗株[30]。

3.4RHΔNPT1弱毒株NPT1基因是弓形蟲假定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員，它在弓形蟲攝取陽離子氨基酸的過程中起著重要作用[31]。在弓形蟲RH株上敲除NPT1基因后構(gòu)建RHΔNPT1菌株，用1×106個RHΔNPT1速殖子免疫小鼠后再用RH、PYS和Pru蟲株的速殖子和Pru蟲株的包囊通過不同的感染途徑攻擊感染小鼠，均100%存活[31]。RHΔNPT1弱毒株不僅能完全保護(hù)不同基因型弓形蟲株的急性感染，在慢性感染中還能提高小鼠的存活率，減少腦包囊的形成[31]，也是一種具有潛力的弓形蟲減毒活疫苗株。

3.5ME49Δldh弱毒株LDH1和LDH2均為弓形蟲乳酸脫氫酶基因，將這兩個基因敲除后的弓形蟲突變株為Δldh，Δldh速殖子在體外生長良好但在小鼠體內(nèi)不能繁殖[32]。Δldh接種小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，也引起部分的體液免疫應(yīng)答，Δldh的毒力嚴(yán)重減弱，但其誘導(dǎo)的強(qiáng)烈免疫力在30 d內(nèi)可對弓形蟲Ⅰ型毒株的攻擊產(chǎn)生有效的防護(hù)[32]，所以Δldh顯示了它作為候選弱毒疫苗的巨大潛力。

3.6RHΔMORN1弱毒株 通過CRISPR-Cas9技術(shù)還探究了MORN1和MORN2基因在弓形蟲I型RH株中的功能，MORN的全稱為Membrane Occupation and Recognition Nexus，中文可翻譯為膜占位和識別聯(lián)結(jié)小體，MORN1伴隨子代速殖子的產(chǎn)生[33]。研究證實MORN2基因的缺失不影響RH株在體外的生長速度，RHΔMORN1缺失株能夠長時間刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有效保護(hù)小鼠抵抗急性、慢性以及先天性弓形蟲感染，可作為弓形蟲候選弱毒疫苗株[33]。

3.7ME49ΔADSL弱毒株ADSL基因是弓形蟲腺琥珀酸裂解酶基因，弓形蟲是嘌呤缺陷型生物，ADSL基因參與弓形蟲宿主嘌呤的相互轉(zhuǎn)化和補(bǔ)救合成[34]。在弓形蟲Ⅱ型ME49蟲株的基礎(chǔ)上對ADSL基因進(jìn)行敲除，可以降低其速殖子生長速度，并且可以減弱其形成包囊的能力[34]。用100個ME49ΔADSL速殖子單次免疫小鼠可以對Ⅰ型RH株、Ⅱ型ME49株和Ⅲ型VEG株的攻擊產(chǎn)生有效的保護(hù)作用[34]，ME49ΔADSL弱毒株可明顯提高小鼠存活率和減少形成包囊的數(shù)量，在免疫后30 d或70 d再次用野生毒株對其進(jìn)行攻擊感染，小鼠存活率均為100%[34]，所以該弱毒株可作為一種很有潛力的弓形蟲弱毒疫苗株進(jìn)行深入研究。

4 展 望

綜上所述，弓形蟲的弱毒疫苗研究取得了重要進(jìn)展，尤其是CRISPR-Cas9技術(shù)在弓形蟲中的應(yīng)用，加快了弓形蟲弱毒疫苗株的構(gòu)建及評價的速度。CRISPR-Cas9技術(shù)也有自身的缺陷，例如脫靶率較高，PAM序列限制等問題。通過敲除形成的弱毒疫苗株存在不能完全防止水平傳播和垂直傳播、不能100%阻止包囊的形成等缺陷；弱毒株對免疫功能缺陷者會不會產(chǎn)生反毒現(xiàn)象？這些弓形蟲基因敲除弱毒株目前只在小鼠模型上取得了較好的保護(hù)作用，在其他動物模型如貓及食品動物或者人類身上是否同樣適用？這一系列問題還有待進(jìn)一步解決。

到目前為止，弓形蟲弱毒疫苗株只在小鼠上進(jìn)行了毒力評價，還需要進(jìn)一步在食品動物體內(nèi)進(jìn)行評價，尤其是豬、牛、羊等。除單基因敲除外，我們應(yīng)該考慮構(gòu)建多基因敲除株。在未來弓形蟲疫苗的研制中候選基因的選擇、免疫佐劑、免疫劑量、免疫途徑的優(yōu)化等，這些都是弓形蟲疫苗研究中需要攻克的難關(guān)。弓形蟲病的最終防控是希望弓形蟲疫苗能在貓上成功應(yīng)用，從而阻斷弓形蟲的傳播。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，最終將研發(fā)出安全有效且對人、貓和各種食品動物完全保護(hù)的弓形蟲疫苗，保護(hù)人類健康和促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

利益沖突：無