針灸促進血管新生作用機制研究進展?

魏慶雙 梁 吉 祁美慧 姜 凡 孫忠人 吳建麗△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150001；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

血管新生是一個動態(tài)的復雜生物學過程，是多種細胞因子對血管內(nèi)皮細胞和周細胞綜合調(diào)控的結(jié)果，在生長發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、冠心病、腦卒中、脊髓損傷等生理和病理修復過程中發(fā)揮著重要作用［1］。血管屬于中醫(yī)學“血脈”“血絡”“經(jīng)絡”范疇，是人體氣血運行的載體，其中絡脈中的血絡與微血管具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。針灸具有活血通經(jīng)、消瘀散結(jié)的功效，是治療缺血性疾病的重要外治法?，F(xiàn)代研究表明［2］，針灸能調(diào)整毛細血管袢排列、血流速度、血液黏度等改善微循環(huán)，還能促進毛細血管新生，建立有效側(cè)支循環(huán)維持營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應，降低缺血區(qū)細胞損傷程度。本文將近年來針刺促進血管新生的相關(guān)機制進行歸納和總結(jié)，現(xiàn)綜述如下。

1 血管新生概述

血管新生是指新生的毛細血管從已存在的血管中出芽與再塑的過程，包括出芽和套疊兩種方式。出芽方式是指新生的毛細血管在原有血管基礎(chǔ)上發(fā)芽，呈線性向缺氧源方向生長，直至與其他血管相連、融合成新的微血管網(wǎng)［3］；套疊方式是指原有微血管內(nèi)皮細胞向管腔內(nèi)延伸、連接形成雙分子層，繼而基底膜和細胞外基質(zhì)在雙分子層中心穿孔，誘導周細胞遷入形成微柱，最終把原血管縱向分為兩條新的毛細血管［4］。血管重建時，兩種新生方式常常同時存在。有研究指出［5］，皮膚修復早期血管新生以芽生為主，中期以后出現(xiàn)套疊式新生，腦血管新生模式以芽生為主，而肺血管以非芽生為主。

血管新生的過程可分為初期、增生期和成熟期3個階段。初期，在組織損傷或炎癥介質(zhì)的刺激下，血管誘導因子分泌增多，啟動血管新生現(xiàn)象。增生期，微血管細胞外基質(zhì)降解，管腔壁上細胞粘附性下降，內(nèi)皮細胞開始向周圍組織增遷移和侵入。成熟期，內(nèi)皮細胞分化、延伸形成新的血管腔，微血管網(wǎng)密度增大，經(jīng)過修飾后發(fā)育為有功能的成熟微血管。缺血缺氧后，局部組織發(fā)生血管新生抑制現(xiàn)象，導致代謝產(chǎn)物堆積和氧分供應不足，引起細胞腫脹甚至壞死。

2 針灸促進血管新生的相關(guān)機制

2.1 針灸對血管新生相關(guān)細胞的調(diào)控

毛細血管由內(nèi)皮細胞、周細胞和基底膜構(gòu)成。血管新生時，內(nèi)皮細胞間連接形成的毛細血管結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，而周細胞募集、遷移到內(nèi)皮細胞管腔外保證了新生血管床的穩(wěn)定性，促進了新生血管的成熟，兩種細胞相互聯(lián)系共同新生血管的形態(tài)和功能。

2.1.1 針灸調(diào)控內(nèi)皮細胞促進血管新生 血管內(nèi)皮細胞主要來源于兩部分，一為骨髓內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的分化，二是原有內(nèi)皮細胞的有絲分裂。組織受損發(fā)出的信號會促使骨髓EPCs動員、遷移至外周循環(huán)參與血管新生。有研究認為循環(huán)中EPCs數(shù)量可作為缺血性疾病臨床預后獨立預測因子。蔡紹皙等［6］觀察電針對腦缺血大鼠外周血EPCs的影響，發(fā)現(xiàn)造模48 h后針刺組EPCs數(shù)量升高，說明針刺可以通過動員EPCs的誘導缺血部位血管新生。謝宸宸等［7］采用流式細胞術(shù)檢測CD34+標記的EPCs數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針可激活和募集骨髓EPCs數(shù)量并動員EPCs釋放到外周血中，促進腦缺血功能恢復。金哲峰等［8］采用vWF和Ki67雙標記內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)電針組在腦梗死12 h后即出現(xiàn)血管內(nèi)皮有絲分裂，增殖時間明顯早于模型組，提示電針可能促進內(nèi)皮細胞增殖，建立側(cè)支循環(huán)恢復腦血流，減輕神經(jīng)損傷。姜桂寧［9］采用植塊法培養(yǎng)急性心肌缺血大鼠微血管內(nèi)皮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)穴后內(nèi)皮細胞活力增強，而凋亡率明顯降低?？梢?，針灸既能調(diào)控內(nèi)源性EPCs增殖、遷移、分化為內(nèi)皮細胞，又可直接促進內(nèi)皮細胞有絲分裂，構(gòu)建新的毛細血管網(wǎng)，改善缺血缺氧狀態(tài)。

2.1.2 針灸調(diào)控周細胞促進血管新生 血管新生早期，周細胞募集到血管壁周圍以縫隙連接、緊密連接、釘-槽復合體和黏著斑的方式緊貼在內(nèi)皮細胞基底面，對管壁給予物理支持，保證新生血管床的穩(wěn)定性，還能旁分泌血管誘導因子與內(nèi)皮細胞進行對話，促進內(nèi)皮細胞增殖和定向遷移，影響新生血管出芽的速度和方向，而血管新生后期周細胞會抑制內(nèi)皮細胞分化，促進新生微血管逐漸成熟。研究表明［10］，缺血性疾病血管功能低下的主要原因為形成的管腔缺乏周細胞的包繞和固定，穩(wěn)定性差，容易發(fā)生碎裂和降解。張虹等［11］探討電針瞳子髎、胰俞和三陰交穴治療糖尿病視網(wǎng)膜血管病變機制，結(jié)果顯示造模后視網(wǎng)膜血管壁周細胞腫脹明顯，有影細胞樣改變，數(shù)量較少，而針刺組周細胞扁平，核橢圓，突起較多，數(shù)量明顯增多，提示針刺能促進周細胞增殖提高微血管穩(wěn)定性而改善視網(wǎng)膜血管病變。張洪俠等［12］在兔動脈粥樣硬化斑塊模型實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組新生血管以單層內(nèi)皮細胞為主，而電針組新生血管壁上周細胞顯著增多，推測電針可能加快周細胞向內(nèi)皮細胞的募集，催化血管成熟從而發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的效應。

2.2 針灸對血管新生相關(guān)因子的影響

血管新生過程受到多種血管誘導因子和抑制因子的調(diào)控［13］。正常生理狀態(tài)下，兩種功能相反因子的動態(tài)平衡使微血管數(shù)量保持在一個穩(wěn)定的范圍，不會發(fā)生過度增生；在缺血缺氧或炎癥刺激下，血管誘導因子大量分泌，平衡狀態(tài)被打破就會刺激新血管的形成。常見的血管新生誘導因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促血管生成素、血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素生長因子等；血管新生抑制因子則包括內(nèi)皮抑素、基質(zhì)金屬蛋白酶、血管抑素等。

2.2.1 針灸對血管新生誘導因子的調(diào)控 VEGF是一類調(diào)控血管和淋巴管生成的小分子蛋白肽，常以二聚體形式存在于血管內(nèi)皮細胞中，能催化合成蛋白水解酶，降解基底膜為血管新生做準備，還能結(jié)合細胞膜上VEGF受體CVEGFR促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，誘導血管新生［14］。昝興淳等［15］觀察針康法對大腦中動脈腦缺血大鼠血管新生相關(guān)因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合康復訓練后腦內(nèi)VEGF、VEGFR表達量和CD34+陽性細胞數(shù)明顯高于模型組，表明針刺能促進VEGF分泌加快缺血區(qū)微血管重建，改善局部腦血流，從而縮小腦梗死體積。黃馨儀等［16］制備急性腦出血模型觀察針刺內(nèi)關(guān)和水溝穴對血管新生的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺促血管新生與VEGF在血腦屏障的高表達有關(guān)。徐文博等［17］發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)和心俞穴可以升高急性心肌梗死患者的血漿中VEGF的含量，促進心肌血管新生，減少心肌纖維凋亡。馬重兵等［18］治療噪音性耳聾大鼠的實驗表明，針刺三焦經(jīng)穴能改善噪聲導致的聽力損害，其機制可能與針刺促進VEGF表達，增加耳蝸新生血管改善供氧有關(guān)。

促血管生成素（Ang）是一組特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，家族成員中對管狀分化和修復起關(guān)鍵作用的為Ang-1，其受體是帶有免疫球蛋白和表皮生長因子同源結(jié)構(gòu)域的Tie受體，二者結(jié)合后可促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化成具有遷移能力的頂細胞，向周圍延伸形成偽足圍成管腔，并募集周細胞支撐管壁，保證新生血管的成熟性和穩(wěn)定性［19］。此外，Ang還能抑制內(nèi)皮細胞凋亡，增加細胞連接的緊密性，減少血管萎縮和退化，維持新生血管的穩(wěn)定性。邵妍等［20］觀察眼針對腦缺血模型大鼠缺血半暗袋內(nèi)新生血管的影響，發(fā)現(xiàn)眼針組Ang-1和Tie-2蛋白表達與mRNA水平明顯高于模型組，說明眼針可能通過啟動Ang/Tie-2信號軸，促進血管新生建立側(cè)支循環(huán)改善腦血流。石學慧等［21］采用巨刺法干預腦缺血模型，結(jié)果表明針刺人中、百會穴可有效改善腦缺血區(qū)神經(jīng)元的損傷程度，其機制可能與增加大腦皮質(zhì)內(nèi)Ang-1表達，促進血管新生有關(guān)。李超然等［22］對皮膚壓瘡模型進行研究，發(fā)現(xiàn)電針傍刺可調(diào)節(jié)Ang-1、Ang-2的釋放，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，縮短創(chuàng)面愈合時間。

血小板源性生長因子（PDGF）是由血小板脫顆?；蚪M織細胞釋放的一種分泌蛋白，其中PDGF-B是生理性和病理血管新生中起關(guān)鍵性作用，常以二聚體的形式作用于周細胞表面的PDGFR-β受體，促進周細胞有絲分裂、募集至毛細血管外壁，維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［23］，還能刺激周細胞分泌VEGF促使內(nèi)皮細胞分裂誘導管腔形成，增殖的內(nèi)皮細胞又能釋放PDGF-B提高周細胞存活率。賈藍羽等［24］觀察電針水溝穴對腦梗死大鼠不同時間點血管新生的效應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針干預后3、6 h，PDGF-B mRNA和蛋白表達均高于模型組，提示電針能促使PDGF-B表達時相前移加快血管新生。桑鵬等［25］研究證實針刺可以提高腦梗死大鼠腦干內(nèi)PDGF-B和PDGFR-β的表達，且針刺陽經(jīng)的作用最強，推測促進PDGF-B釋放，加快血運重建可能是針刺改善偏癱痙攣狀態(tài)的重要機制。

2.2.2 針灸對血管新生抑制因子的調(diào)控 內(nèi)皮抑素（ES）是膠原蛋白碳末端的降解片段，是已知最強的內(nèi)源性血管生成抑制因子。ES能與膜表面的整合蛋白結(jié)合，降低局部黏著斑激酶活性，下調(diào)MAPK信號通路抑制內(nèi)皮細胞遷移，使細胞周期停止，影響內(nèi)皮細胞存活。ES還能干擾血管誘導因子對酪氨酸激酶的信號轉(zhuǎn)導，抑制抗凋亡基因表達從而促使內(nèi)皮細胞凋亡。李斯亮等［26］以腦缺血大鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)電針可明顯促進腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復，縮小梗死面積，其機制可能與電針抑制ES對血管新生的負反饋調(diào)節(jié)，增加血管新生的數(shù)量，改善腦部微循環(huán)有關(guān)。王歡等［27］采用眼針干預腦缺血再灌注模型大鼠，發(fā)現(xiàn)眼針可明顯抑制缺血區(qū)ES的表達，說明眼針可能通過抑制ES促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，誘導血管生成減輕腦損傷。

血管抑素（AS）是纖維蛋白溶解酶原溶解后的片段，可與內(nèi)皮細胞表面的ATP酶相結(jié)合，降低細胞內(nèi)的pH值，觸發(fā)細胞凋亡。研究表明［28］，AS能夠促進內(nèi)皮細胞凋亡，抑制遷移形成管腔，但對內(nèi)皮細胞有絲分裂沒有影響。唐強等［29］采用頭穴叢刺聯(lián)合康復訓練治療永久腦缺血大鼠，結(jié)果顯示針康法能降低造模3、7、14 d后AS蛋白的表達，提高大鼠的神經(jīng)功能評分。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能降解細胞外基質(zhì)膠原鏈和纖溶酶原，產(chǎn)生內(nèi)源性血管抑制因子，發(fā)揮抗血管新生作用。黃馨儀等［16］采用免疫組化檢測MMPs在腦缺血大鼠組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺內(nèi)關(guān)、水溝穴后血腦屏障MMP-2和MMP-9陽性細胞表達明顯減少，針刺能促進血管新生減輕腦細胞損傷。

2.3 針灸對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控

血管新生誘導因子與內(nèi)皮細胞或周細胞膜上的酪氨酸激酶受體結(jié)合后，將引起受體構(gòu)象改變，在近膜段發(fā)生磷酸化，進而激活下游信號通路，調(diào)節(jié)細胞有絲分裂和存活，促進偽足形成，增強細胞外基質(zhì)粘附性，引導相鄰偽足粘接形成環(huán)狀血管結(jié)構(gòu)。

2.3.1 針灸對細胞增殖和存活信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控血管新生誘導因子與酪氨酸激酶受體結(jié)合后，在近膜段發(fā)生磷酸化，激活下游的PI3K/Akt、RAS/RAF、PLCγ 1/PKC等信號通路，從而提高血管內(nèi)皮細胞和周細胞的增殖和存活率。于杰等［30］用艾灸治療壓瘡的實驗表明，艾灸能促進CD31+PCNA+標記的內(nèi)皮細胞新生血管數(shù)量的增多，提高創(chuàng)面RAS mRNA和蛋白表達，上調(diào)RAF和ERK磷酸化水平，說明艾灸可能激活RAS/RAF/ERK通路促進內(nèi)皮細胞增殖，誘導血管新生。胥虹貝等［31］以腦缺血再灌注模型為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針能增加骨髓p-Akt和eNOS含量及骨髓和外周血EPCs數(shù)量，抑制劑阻斷PI3K后，缺血區(qū)微血管密度降低，提示電針能上調(diào)PI3K/Akt/eNOS通路，動員骨髓EPCs至外周血，促進腦血管再生。張江松等［32］也發(fā)現(xiàn)電針百會、水溝穴能提高腦缺血組織PKC磷酸化水平，提高內(nèi)皮存活率和構(gòu)象改變，誘導血腦屏障結(jié)構(gòu)開放。

2.3.2 針灸對細胞偽足和血管網(wǎng)絡形成信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控 血管內(nèi)皮細胞有絲分裂后，Rho家族（如Rac和Cdc等蛋白）接收上游血管誘導因子信號后引導內(nèi)皮細胞伸出特殊的絲狀或板狀偽足，并通過調(diào)控肌動蛋白活性影響其形態(tài)變化，促使絲狀偽足在細胞外基質(zhì)區(qū)相互連接、融合形成環(huán)狀血管，建立新的血管網(wǎng)絡。研究表明［33］，激活Rac/Cdc42信號通路能提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外管腔形成能力且增強血管的穩(wěn)定性。譚峰等［34］證實大腦中動脈閉塞后Rac-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低會引起遠離梗死灶的頸髓發(fā)生繼發(fā)性損傷，而電針百會和大椎穴能上調(diào)皮層和頸髓Rac-1的表達，促進缺血區(qū)內(nèi)皮細胞偽足形成和再生，參與神經(jīng)功能修復。張柳娟等［35］采用免疫印跡和組化技術(shù)檢測脊髓損傷節(jié)段Cdc42的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)夾脊電針能增加Rho家族下游因子Cdc42蛋白表達，促進偽足的生長和延伸，但是否特異性增強新生血管內(nèi)皮細胞連接強度還需進一步證實。

3 結(jié)語

內(nèi)皮細胞是血管新生過程中形成管壁的主要成分，而周細胞對成管后的內(nèi)皮細胞有重要的支撐作用，兩種細胞在血管新生誘導因子的作用下，激活胞質(zhì)下游的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應，發(fā)生有絲分裂和遷移，形成結(jié)構(gòu)完整且形態(tài)穩(wěn)定的新生血管，實現(xiàn)血管由“少到多”的生物學過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，針灸治療心肌梗死、腦卒中及脊髓損傷等缺血性疾病能正向促進微血管新生，加快血運重建，改善局部缺血缺氧狀態(tài)，其發(fā)揮效應的作用靶點主要是通過調(diào)節(jié)促進和抑制血管新生因子比例，作用于鄰近微血管壁的內(nèi)皮細胞和周細胞，進而激活細胞增殖、分化和連接通路，誘導血管生成。

近年來，通過針灸對缺血性模型的干預，其促血管新生的機制研究已取得一定進展，但仍有許多問題尚未解決：1）周細胞是支撐管腔、促進新生血管發(fā)育成熟的重要組分，但目前針刺對周細胞的研究較少，僅觀察其在微血管壁的形態(tài)學改變，而未能明確其增殖狀態(tài)與新生微血管密度的關(guān)系，后續(xù)研究可考慮應用熒光雙標標記周細胞觀察其增殖和存活率，并結(jié)合微血管密度檢測，進一步揭示針刺調(diào)控周細胞對血管新生作用的規(guī)律；2）針灸刺激腧穴后是由何種物質(zhì)或信號傳遞至病變部位誘導微血管新生的機制還尚未可知，是否與腧穴局部微環(huán)境物質(zhì)變化的體液調(diào)節(jié)或電信號改變的神經(jīng)傳導有關(guān)需要進一步驗證，建議借助質(zhì)譜技術(shù)檢測腧穴與病變部位的組織液成分差異，或通過電生理技術(shù)觀察動作電位變化探索其效應機制；3）相同疾病下，選擇不同腧穴、針刺手法、電針刺激頻率、治療次數(shù)對血管新生的時間點和發(fā)育成熟是否產(chǎn)生影響，仍需深入研究；4）血管新生過程涉及的因子和信號通路較多，機制較為復雜，但針灸促血管新生機制研究的深度還不夠，建議采用高通量測序或基因芯片技術(shù)篩選出與針刺干預相關(guān)的差異分子，在功能驗證后進一步闡釋其作用機理。