水凝膠用于牙髓再生的研究進展

曹春玲 韓冰 王曉燕

北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院牙體牙髓科 國家口腔疾病臨床研究中心

口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室 北京100081

牙髓再生是近年來牙髓病治療研究的熱點和難點。美國牙髓病學會將牙髓再生定義為“用生物手段，取代受損的牙體組織、牙根、牙髓-牙本質復合體等結構，形成有功能的牙髓樣組織”。牙髓再生的研究主要利用組織工程學原理和手段，通過異體/自體/歸巢干細胞-支架-生長因子復合體誘導分化出牙髓-牙本質復合體，修復受損牙髓組織并恢復其生理功能。其中，支架材料發(fā)揮著重要的橋梁作用。目前，支架材料不僅局限于為細胞種植、黏附、增殖和空間分布提供三維結構骨架，還起著發(fā)揮調控細胞行為和細胞內(nèi)信號傳遞，模擬復原細胞生活微環(huán)境——細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的作用。

水凝膠是在水中可以溶脹的高分子網(wǎng)絡體系，它由單體經(jīng)過交聯(lián)反應形成，在結構和性能上具有不同于其他生物材料的特點。水凝膠形成的高分子網(wǎng)絡能夠束縛水分，高含水量使其具有良好的生物相容性。當水凝膠置于生物組織中時，其溶脹性使得水凝膠與組織的邊界趨于模糊，表面張力降低，細胞和蛋白在其表面黏附減少，因此減少了異物反應。水凝膠與周圍組織之間的摩擦力小，可以避免周圍組織受損。水凝膠的三維網(wǎng)絡結構和黏彈性與細胞外基質極為類似，可以模擬細胞生活的三維微環(huán)境，有利于細胞增殖和分化。目前水凝膠已用于皮膚、肝臟、血管、軟骨、骨和肌肉組織再生的研究。

在組織工程中，如何使細胞種植入支架后能在支架中均勻分布，以及如何將支架置入作用部位是其中的關鍵問題之一，這在牙髓再生中尤為重要。水凝膠可以制備成可注射劑型，在凝膠化前可通過注射的方式使液體充分填充髓腔和根管，然后再發(fā)生凝膠反應。這使得水凝膠與周圍組織密切貼合，非常適合在牙髓再生研究中應用。水凝膠包封細胞后發(fā)生溶膠-凝膠轉化，可使細胞在凝膠內(nèi)部分布較為均勻，可能解決牙髓再生中外源細胞難以深入根管內(nèi)支架深部的問題。由此可見，水凝膠材料在牙髓組織工程中有著其他材料不可比擬的優(yōu)勢。近年來水凝膠用于牙髓再生受到學者們關注，下面按照水凝膠組成分類，將其在牙髓再生領域研究進展進行綜述。

1 天然高分子水凝膠

天然高分子水凝膠材料主要包括膠原/明膠、藻酸鹽、透明質酸、殼聚糖、纖維素等。其中，在牙髓再生領域應用的主要有膠原基水凝膠、殼聚糖基水凝膠和透明質酸基水凝膠。藻酸鹽材料由于其不利于細胞黏附，較少作為單組分水凝膠用于牙髓再生的研究，常作為復合水凝膠的材料成分之一，與其他高分子共同發(fā)揮功能[1-4]。

1.1 膠原基水凝膠

膠原基水凝膠是最廣泛應用于牙髓組織工程的水凝膠支架材料。膠原能夠被細胞識別，并能被細胞所分泌的蛋白酶降解，因此具有很好的生物學特性[5]。在一定條件下，膠原分子能自發(fā)形成膠原纖維，并在水性溶劑中形成水凝膠。然而，單一成分的膠原基水凝膠的物理性能不理想[6]，在含水時難以塑形，無法支撐組織重建。此外，天然膠原常來源于異種生物，因此容易導致免疫反應。

近年來出現(xiàn)了安全性較高的人重組膠原支架，它與人體組織內(nèi)的Ⅰ型膠原具有相同的氨基酸序列[7]，明顯減輕了排斥反應。Rosa等[8]將脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）和人重組膠原水凝膠混合注入發(fā)育完全的人牙根管中，發(fā)現(xiàn)SHED能存活且分化為成牙本質樣細胞。膠原基水凝膠可制備為可注射水凝膠，如Yuan等[9]制備了以Ⅰ型膠原與Ⅱ型膠原為主要成分的可注射膠原基水凝膠。Suzuki等[10]發(fā)現(xiàn)，結合趨化因子的Ⅰ型鼠尾膠原基水凝膠也可作為細胞歸巢的支架，但應用時存在體內(nèi)縮水及降解過快等不足。如何在提高膠原穩(wěn)定性的同時保持膠原活性，是今后膠原基水凝膠材料需要解決的難題。

1.2 透明質酸基水凝膠

透明質酸是一種構成細胞外基質的蛋白多糖，其共價交聯(lián)形成的水凝膠具有良好的生物相容性。在透明質酸基水凝膠中添加基質金屬蛋白酶的酶切位點，使其具有了良好的降解性能[11]。但單一成分的透明質酸基水凝膠的機械性能較差，需要通過復合其他組分或化學修飾以改善性能。

2009年，有學者[12]研發(fā)了酪胺化的透明質酸基水凝膠CorgelTM。這種水凝膠在添加過氧化氫引發(fā)劑后發(fā)生凝膠化，并且能在一定程度上抵抗透明質酸酶消化，維持相對穩(wěn)定性。Lambricht等[13]比較了2種海藻酸鹽基水凝膠和CorgelTM對根尖牙乳頭干細胞（stem cell from apical papilla，SCAP）的影響，發(fā)現(xiàn)SCAP在這種透明質酸基水凝膠中能夠維持增殖活性和向成牙本質樣細胞分化。另一種商品化透明質酸基水凝膠RestylaneTM含有甘油醚交聯(lián)劑（butanediol diglycidyl ether，BDDE），目前作為填充劑已廣泛應用于醫(yī)療美容，與人體相容性好，具有原位可注射性且可吸收。Chrepa等[14]發(fā)現(xiàn)，RestylaneTM作為支架材料在體外能促進人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）成牙本質向分化。目前未見其應用于動物體內(nèi)牙髓再生的研究報道。

1.3 殼聚糖基水凝膠

殼聚糖是天然多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，可以通過物理締合（如結合陰離子、聚電解質、添加聚合物等）或交聯(lián)（化學交聯(lián)、互穿網(wǎng)絡）形成殼聚糖基水凝膠，并可以精確地獲得需要的孔徑大小、交聯(lián)程度和溶解度。殼聚糖基水凝膠由于其良好的生物相容性、生物降解性和天然抗菌作用，還可作為多種藥物的緩釋/控釋載體，在生物醫(yī)學領域得到了深入的研究和應用。

研究[15-16]顯示，殼聚糖基水凝膠構成的地塞米松釋放系統(tǒng)可以調節(jié)藥物釋放的速率，不同程度地促進SCAP的增殖和分化。在牙髓組織工程中，Park等[17]研發(fā)了殼聚糖基的熱響應型水凝膠，體外研究顯示這種水凝膠聯(lián)合使用釉質基質衍生物能夠促進DPSCs的增殖和分化。多項研究[18-21]均表明，殼聚糖對于牙源性干細胞的增殖和分化有良好的促進作用。殼聚糖基水凝膠可通過改性實現(xiàn)在體內(nèi)的可注射性和原位凝膠化[22]，具有可注射型支架的應用前景。但是，單一組分的殼聚糖基水凝膠也有與其他天然高分子水凝膠相似的弱點，即機械強度差。此外，殼聚糖在體內(nèi)的降解機制尚未明確，體內(nèi)降解過程較難調控。

1.4 纖維素基水凝膠

纖維素的納米晶體（cellulose nanocrystals，CNC）因其具備一定的剛性和機械強度，常作為復合水凝膠中的填料摻入水凝膠網(wǎng)絡中。但是，它們“纏結”的能力有限，不適用于構建單組分凝膠。纖維素納米原纖維（cellulose nanofibrils，CNF）具有更好的柔韌性和纏結傾向，更易形成水凝膠。有學者[23]發(fā)現(xiàn)，CNF水凝膠作為細胞培養(yǎng)支架具有細胞毒性小且能誘導細胞球狀體形成的優(yōu)點。然而，單一成分的纖維素基水凝膠機械性能相對較弱，且缺乏宏觀結構或層次結構，限制了其作為仿生水凝膠的進一步應用。目前尚無纖維素單組份水凝膠用于牙髓再生的研究報道。體外研究[24]發(fā)現(xiàn)，DPSCs在羧甲基纖維素-羥磷灰石水凝膠中具有良好的成骨向分化和成牙向分化能力。

1.5 藻酸鹽基水凝膠

藻酸鹽基水凝膠作為1種天然的生物材料，具有良好的生物相容性并且易于凝膠化，在傷口愈合、載藥和組織工程中廣泛應用。由于缺乏哺乳動物細胞黏附受體和對蛋白質的低吸附性，藻酸鹽基水凝膠可以作為一個理想的“空白支架”，允許多種方式修飾，從而改善其性能。在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）黏附配體修飾的藻酸鹽溶液中，細胞可以形成均勻的分散體。該體系通過特定的受體-配體相互作用生成交聯(lián)的網(wǎng)絡結構，無需使用任何其他的交聯(lián)分子。有研究[25]發(fā)現(xiàn)，與未添加黏附配體的藻酸鹽基水凝膠相比，RGD-藻酸鹽基水凝膠使細胞黏附和增殖能力顯著增強。在牙髓再生方面，RGD-藻酸鹽基水凝膠包載了血管內(nèi)皮生長因子和成纖維生長因子后，能促進DPSCs/人臍靜脈上皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的黏附、增殖和分化[26]。但是，藻酸鹽的純度差異可能會引起細胞的免疫反應，目前仍需要更加標準化的方法去除藻酸鹽中的雜質成分[27]。

2 發(fā)展中的合成高分子水凝膠

合成高分子水凝膠通常具有規(guī)則的結構，并且可設計修飾某些功能基團，從而實現(xiàn)功能調控。在組織工程中研究較多的聚合物主要有聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚乙醇酸（polyglycolide acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚己酸內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）和多肽聚合物等。除多肽聚合物外，其余聚合物均為惰性材料，無生物活性，且其降解產(chǎn)物多為酸性，從而造成局部環(huán)境的改變，難以作為單一成分的水凝膠支架用于牙髓組織工程。因此，這些惰性聚合物多與明膠/膠原/殼聚糖等交聯(lián)形成復合水凝膠用于牙髓再生的研究。Galler等[28]將可注射PEG-纖維蛋白水凝膠用于牙髓再生的體內(nèi)實驗研究，獲得了血管化的類牙髓樣結締組織。

目前，由多肽聚合物在低濃度溶液中自組裝成的具有纖維結構的多肽（self-assembling peptide，SAP）水凝膠已成為研究熱點之一。在組織工程應用中，SAP水凝膠具有良好生物相容性和可降解性，能構建納米級支架[29]和緩釋系統(tǒng)[30-31]，可設計功能性的氨基酸序列以滿足不同類型細胞的生長需要[32]。改變多肽濃度能使水凝膠的硬度和粘度發(fā)生變化，從而改變水凝膠的可塑性[33]。Puramatrix水凝膠是一種商品化的可注射型SAP水凝膠。Dissanayaka等[34]用PuraMatrix同時包載HUVECs和DPSCs進行動物體內(nèi)實驗，觀察到形成了豐富的血管網(wǎng)。但是SAP水凝膠的制備工藝復雜，成本較高，獲取途徑有限，這對SAP水凝膠的推廣應用有一定的限制。

3 以天然水凝膠為主要成分的復合水凝膠

天然水凝膠能維持較高的細胞存活率，而合成水凝膠能更好地控制其物理和機械性質，不同凝膠組分在交聯(lián)過程中形成的互穿網(wǎng)絡結構也會改變凝膠的理化性能。因此，以天然水凝膠為主要成分的復合水凝膠逐漸成為研究趨勢。復合水凝膠有2種形式：共聚物水凝膠和互穿網(wǎng)絡聚合物（interpenetrating polymer network，IPN）水凝膠。共聚物水凝膠是由兩種或多種不同的單體沿著聚合物網(wǎng)絡的鏈以不規(guī)則、嵌段或交替構型排列形成，而IPN水凝膠是由兩種合成和/或天然聚合物成分分別獨立交聯(lián)形成的網(wǎng)絡結構[35]。

研究[36]報道，藻酸鹽與膠原復合水凝膠的機械性能增強，且能維持較好的生物相容性和細胞均勻分布特性。藻酸鹽質量分數(shù)在0.5%~1%范圍內(nèi)能使復合水凝膠具有較好的彈性模量和適宜的剛性，使得DPSCs能在生長因子誘導下增殖和分化[37]。Ravindran等[38]發(fā)現(xiàn)ECM-膠原-殼聚糖復合支架可以誘導DPSCs向成牙本質方向分化，并在動物體內(nèi)實驗中觀察到血管形成。目前，可注射的復合水凝膠在牙髓組織工程中具有良好的應用前景[39-40]。可注射的甲基丙烯酸酯明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝膠用于DPSCs/HUVECs的培養(yǎng)，可促進細胞的黏附和增殖，同時促進血管的新生[41]。研究[38]顯示，由聚乙二醇二丙烯酸酯-透明質酸-明膠合成的可注射復合水凝膠HyStem-C對DPSCs具有良好的相容性，DPSCs可在其中遷移、生存和增殖。但是在牙髓組織工程中，目前僅有少量特定組分的復合水凝膠進行了體外或動物體內(nèi)研究，尚無臨床研究報告。此外，尚缺乏不同復合水凝膠應用于牙髓組織再生的對比研究。

綜上所述，在牙髓再生研究領域中，理想的水凝膠支架材料不僅應具有優(yōu)異的生物學性能，可以模擬ECM，參與釋放信號分子，調控干細胞的行為，還應具有優(yōu)良的理化性能，包括適宜的強度、合適的孔隙率、與組織新生速率相匹配的降解速率，以及可原位注射適應根管形態(tài)的特性。從成分上來說，膠原、殼聚糖和透明質酸是經(jīng)典且具有良好生物學特性的凝膠組分，多肽水凝膠目前處于前沿研究熱點。牙髓再生支架研究應進一步在不同組分、性質和功能的水凝膠中篩選具備根管內(nèi)應用特性，即可注射且在溫和條件下原位成形的支架材料。然而，如何借助支架材料的發(fā)展，完成從實驗室到臨床的轉化，實現(xiàn)真正的牙髓再生，仍需要進一步的探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。