白色念珠菌、黏性放線菌與根面齲相關(guān)性的研究進(jìn)展

熊開新 鄒玲

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都610041

隨著現(xiàn)代口腔醫(yī)療技術(shù)先進(jìn)性和人們口腔保健意識提高，牙齒在口腔中存留的時間更長，齲病已成為全球患病率最高的疾病之一。老年人存在口腔護(hù)理相對較差、易患系統(tǒng)疾病而導(dǎo)致唾液腺功能受損、過量碳水化合物攝入、認(rèn)知能力下降、牙齦退縮及牙根面暴露等牙周問題十分普遍等多種不利因素，目前老年人的主要口腔問題已由口內(nèi)無牙轉(zhuǎn)變成牙齒齲壞[1]。我國第4次口腔健康流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，55~64歲老年人恒牙患齲率為95.6%，恒牙根齲的患病率為51%；65~74歲老年人恒牙患齲率為98%，恒牙根齲的患病率為61.9%。牙根部牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)的羥磷灰石晶體較小，孔隙度較高，有機(jī)物含量較釉質(zhì)高。牙本質(zhì)中無機(jī)鹽含量約占70%，有機(jī)物和水含量約占30%；牙骨質(zhì)中無機(jī)鹽含量為45%~50%，有機(jī)物和水含量為50%~55%：故根面齲的發(fā)生發(fā)展相對復(fù)雜，不僅包括硬組織脫礦，還包括復(fù)雜的膠原降解過程[2]。一方面，根部牙體組織礦化程度較低，根面齲在pH6.0~6.8，未到臨界值pH5.5時即可發(fā)生[3]，且齦溝內(nèi)大量齦溝液和食物殘渣堆積，微生物極易于牙根部聚集，代謝產(chǎn)酸導(dǎo)致根面脫礦，進(jìn)一步酶解有機(jī)質(zhì)膠原致根面齲快速進(jìn)展；另一方面，充填修復(fù)時存在操作空間的限制、唾液和齦溝液對消毒隔濕的干擾、牙周軟組織對病損區(qū)的覆蓋等不利條件，而且目前尚未開發(fā)出對根面齲洞粘接性能強(qiáng)而穩(wěn)定的修復(fù)材料，這些因素均嚴(yán)重影響了根面齲的修復(fù)及預(yù)后[1,4]。因此，根面齲發(fā)病率高、治愈率低，形勢十分嚴(yán)峻。

牙菌斑是齲病發(fā)生發(fā)展的始動因子。根面齲發(fā)生過程中，首先是微生物代謝產(chǎn)酸致無機(jī)物脫礦，酸性環(huán)境同時激活了宿主來源的內(nèi)源性蛋白酶（主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶）以降解暴露的膠原，隨后微生物產(chǎn)生的蛋白酶（如膠原酶、明膠酶和肽酶等）也開始降解有機(jī)物，齲損逐漸進(jìn)展，形成淺碟狀、著色、軟化的感染病損區(qū)域[2]。白色念珠菌和黏性放線菌作為口腔常駐共生菌群，屬于機(jī)會致病菌，具有產(chǎn)酸、耐酸和酵解有機(jī)物等性能，在根面齲發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本文就白色念珠菌、黏性放線菌與根面齲的研究進(jìn)展作一綜述，以期從真菌-細(xì)菌控制的角度為根面齲的臨床防治提供新思路。

1 根面齲菌斑微生物

放線菌屬、鏈球菌屬和乳桿菌屬是根面齲中較常見的3種菌屬[5]。隨著生物檢測技術(shù)的發(fā)展，丙酸桿菌、齒狀羅氏菌、黏液奈瑟氏球菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、卵形擬桿菌和米氏鏈球菌等也被認(rèn)為與根面齲密切相關(guān)[5-7]。

研究[8]發(fā)現(xiàn)，新發(fā)生根面齲的部位越多，放線菌的組成比例越大；而黏性放線菌不僅在檢出數(shù)量上顯著高于健康牙的根面菌斑，還可滲入牙本質(zhì)深層。Nyvad等[9]通過體外實驗證實，黏性放線菌是脫礦最明顯的實驗性根面齲菌斑中的主導(dǎo)微生物。除細(xì)菌外，根面齲菌斑中還普遍存在真菌。研究[7,10]發(fā)現(xiàn)，根面齲患者牙菌斑中白色念珠菌是最主要的真菌種類，占可檢出真菌總量的98%左右。綜上，白色念珠菌和黏性放線菌在根面齲菌斑樣本中的存在十分普遍，由此推測，二者與根面齲的發(fā)生發(fā)展可能具有一定的相關(guān)性。

1.1 白色念珠菌

白色念珠菌是人類口腔、呼吸消化道以及泌尿生殖系統(tǒng)常見的共生真菌，有菌絲和孢子兩種形態(tài)，隨環(huán)境刺激，兩種形態(tài)可以相互轉(zhuǎn)化，其中菌絲態(tài)具有較高的致病毒力。白色念珠菌具有與變異鏈球菌相似的黏附、酵解碳水化合物、產(chǎn)酸、耐酸和形成生物膜等致齲毒力[11]。

研究[12]發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌可以通過表達(dá)Sap、Als和Hwp1黏附素蛋白介導(dǎo)其在微生物、非生物物質(zhì)（如牙齒表面羥磷灰石及有機(jī)膠原）和宿主細(xì)胞等的表面黏附，Eap1、Iff4、Ecm33、Mp65、Phr1和Int1等蛋白能促進(jìn)白色念珠菌的黏附過程。白色念珠菌還能發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖等多種糖類，形成豐富的胞外基質(zhì)促進(jìn)生物膜聚集[11]。白色念珠菌合成胞外基質(zhì)的過程受Zap1、Gca1、Gca2、Bgl2、Phr1和Xog1等多種蛋白的調(diào)控[12]。另外，白色念珠菌可以酵解碳水化合物產(chǎn)酸，使環(huán)境pH迅速下降。Schlafer等[13]利用一種基于共聚焦的pH檢測方法監(jiān)測真菌生物膜的產(chǎn)酸能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：白色念珠菌具有極強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌臨床分離株可在體外使釉質(zhì)塊脫礦，硬度降低[14]，且與變異鏈球菌共同作用時，顯著增加了牙體硬組織的脫礦程度[15]。白色念珠菌還具有降解膠原的能力，可滲透進(jìn)牙本質(zhì)小管中并結(jié)合至膠原蛋白上，分泌酸性條件下能夠活躍降解膠原蛋白的水解酶，促進(jìn)齲壞進(jìn)程[11-12]；同時，白色念珠菌可通過Rim101信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路感知pH的變化，調(diào)控phr1和phr2基因表達(dá)以耐受酸性環(huán)境[12]，可在pH為4的酸性環(huán)境中生存[16]。白色念珠菌形成生物膜的過程不僅受黏附素相關(guān)基因als和hwp1的調(diào)控[12]，也與Hsp90、Bcr1、Tec1、Efg1、Ndt80、Rob1和Brg1等多種蛋白相關(guān)[12]。有學(xué)者[17]收集健康根面菌斑和齲壞根面菌斑進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：齲壞菌斑中白色念珠菌的代謝活性、糖轉(zhuǎn)運(yùn)、壓力耐受、侵襲和pH調(diào)節(jié)相關(guān)毒力基因的表達(dá)較健康菌斑明顯上調(diào)。綜合這些研究可以推測，白色念珠菌與根面齲的發(fā)生有著重要的相關(guān)性。

1.2 黏性放線菌

黏性放線菌在根面齲發(fā)生的初始階段發(fā)揮了不可替代的作用。黏性放線菌的致齲毒力主要與菌毛介導(dǎo)的黏附聚集作用、持久的產(chǎn)酸耐酸性能，以及蛋白凝固和降解能力有關(guān)。黏性放線菌Ⅰ型菌毛黏附素通過與牙齒膠原或唾液膜中的富脯蛋白（proline-rich polypeptides，PRPs）和富酪蛋白受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌在牙齒表面的黏附，并與牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)中Ⅰ型和Ⅲ型膠原相結(jié)合，進(jìn)一步滲入牙本質(zhì)小管中，加快根面齲的進(jìn)展。本課題組前期體外研究[18]顯示：黏性放線菌可黏附于唾液覆蓋的羥磷灰石表面聚集形成生物膜，且與羥磷灰石之間存在較大的黏附力；Switalski等[19]通過體外研究發(fā)現(xiàn)：黏性放線菌能在30 min內(nèi)快速黏附于牙根表面，且與變異鏈球菌相互競爭黏附位點(diǎn)。黏性放線菌還能代謝淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖等多種碳水化合物，迅速合成大量糖原，持續(xù)降解糖原產(chǎn)酸，且能長時間耐受酸性環(huán)境，保持代謝活性[20]。與健康根面菌斑中分離出來的黏性放線菌相比，根面齲菌斑中分離出來的菌株具有更強(qiáng)的耐酸性和糖原合成能力，并且其降解糖原產(chǎn)酸過程可維持更長的時間，從而引起牙齒脫礦[19-20]。

2 白色念珠菌與黏性放線菌的相互作用

齲病的發(fā)生發(fā)展是多種微生物相互作用、相互影響的結(jié)果。目前白色念珠菌和黏性放線菌之間存在協(xié)同還是拮抗作用尚存爭議。有學(xué)者[21]認(rèn)為：黏性放線菌可以通過產(chǎn)生尼可霉素和格爾德霉素抑制白色念珠菌的增殖、黏附、菌絲形成、生物膜形成和代謝酶活力，推測二者之間存在拮抗作用。但是目前多數(shù)研究認(rèn)為，二者能夠相互作用增強(qiáng)毒力，存在協(xié)同作用。體外實驗[22-23]發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌和放線菌能發(fā)生共聚反應(yīng)，但共聚反應(yīng)受白色念珠菌的菌株種類和培養(yǎng)基種類的影響，菌絲態(tài)生長的白色念珠菌能與放線菌形成更加明顯的共聚效果。還有學(xué)者[24]通過熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：放線菌能與白色念珠菌發(fā)生明顯的共聚反應(yīng)并形成致密的混合生物膜。Morse等[25]的研究結(jié)果顯示：白色念珠菌與黏性放線菌共培養(yǎng)能明顯增加生物膜中的菌絲含量，且共培養(yǎng)生物膜中白色念珠菌的毒力基因，如als3、epa1、pld1、sap4、sap6等的表達(dá)明顯增高。為了進(jìn)一步探索2種微生物之間的相互作用，筆者所在課題組也進(jìn)行了白色念珠菌和黏性放線菌體外共培養(yǎng)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)時，二者的增殖、產(chǎn)酸耐酸、產(chǎn)糖和生物膜形成等致齲毒力明顯增強(qiáng)[18]；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：白色念珠菌erg11基因在介導(dǎo)白色念珠菌與黏性放線菌的相互作用中具有重要作用[26]，但是二者之間具體的相互作用通路還有待進(jìn)一步研究。

3 根面齲治療新方向——以病原微生物控制為基礎(chǔ)的材料改性

目前臨床上根面齲充填修復(fù)后存在充填物脫落及繼發(fā)齲壞等問題[1,27]。通過對根面齲病原微生物進(jìn)行研究，以微生物控制為基礎(chǔ)對修復(fù)材料進(jìn)行抗菌性能改性可以作為根面齲治療的新方向[1]。已有學(xué)者[28-29]通過體外研究發(fā)現(xiàn)：將甲基丙烯酸二甲基氨基己酯（dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMAHDM）、非晶態(tài)磷酸鈣（nanoparticles of amorphous calcium phosphate，NACP）和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC）摻入粘接劑中，改性后的新型粘接劑能夠明顯抑制多種病原菌生物膜的形成能力，減少活菌量及胞外多糖產(chǎn)量。這些多功能粘接劑有望用于齦下邊緣的根面齲治療并預(yù)防繼發(fā)齲的發(fā)生。Zhou等[30]將DMAHDM和NACP摻入復(fù)合樹脂中形成抗菌改性的生物活性復(fù)合樹脂，可明顯降低變異鏈球菌、嗜酸乳桿菌和白色念珠菌單菌種及3菌種生物膜的產(chǎn)酸、產(chǎn)糖能力和活菌數(shù)量，同時抑制生物膜介導(dǎo)的牛牙牙本質(zhì)脫礦。采用這種多功能新型抗菌改性生物活性復(fù)合樹脂修復(fù)根面齲，有望抑制根面齲壞的再發(fā)生。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：將伏立康唑（voriconazole，VRC）摻入粘接劑中形成的抗菌改性粘接劑可明顯抑制白色念珠菌和黏性放線菌雙菌種生物膜的形成能力、代謝活性、產(chǎn)酸及產(chǎn)糖能力，同時明顯降低了生物膜中的活菌比例，可作為根面齲修復(fù)的新型抗菌粘接劑。由此可見，通過研究根面齲病原微生物及其相互作用機(jī)制，并進(jìn)一步篩選出特定藥物進(jìn)行修復(fù)材料抗菌改性，可以作為根面齲防治的新策略。

4 小結(jié)

白色念珠菌和黏性放線菌具有較強(qiáng)的致齲毒力，二者相互作用可促進(jìn)根面齲的發(fā)生發(fā)展；但二者之間的具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。對臨床而言，開發(fā)針對白色念珠菌和黏性放線菌的新型修復(fù)材料可以作為根面齲防治研究的新方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。