葉酸載體基因多態(tài)性與胎兒神經(jīng)管缺陷

裴嬌嬌，謝江燕，伍小莉

神經(jīng)管缺陷（neural tube defect，NTD）是目前最常見(jiàn)和嚴(yán)重的先天性出生缺陷之一，全世界范圍內(nèi)每年大約有30萬(wàn)例NTD嬰兒出生。因此，NTD在世界范圍內(nèi)被認(rèn)為是給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的主要臨床問(wèn)題之一[1]。在我國(guó)，NTD的發(fā)生率為0.08%[2]，明顯低于全球的平均水平（0.186%）[3]，這得益于目前我國(guó)全面實(shí)施孕婦葉酸干預(yù)政策?；加袊?yán)重NTD的胎兒通常不能存活到足月（如無(wú)腦兒），大約9%～10%幸存下來(lái)的NTD患兒在兒童期間死亡[4]，極少數(shù)輕癥NTD患者也很可能患有嚴(yán)重的殘疾[5]。NTD以散發(fā)病例為主，其病因復(fù)雜，包括飲食、環(huán)境和遺傳等[3-4，6]。眾所周知，孕婦補(bǔ)充葉酸可以顯著降低NTD患兒的出生風(fēng)險(xiǎn)，然而這種保護(hù)性效應(yīng)的確切機(jī)制尚不完全清楚。葉酸在多種細(xì)胞代謝途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，包括核苷酸和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，組蛋白甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以及將同型半胱氨酸甲基化成為蛋氨酸。妊娠期間，由于胎兒細(xì)胞的快速分裂和增殖，對(duì)葉酸的需求量也會(huì)顯著增加。而影響胎兒葉酸濃度的關(guān)鍵是母親血液葉酸濃度和葉酸胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)能力[7]。目前，胎盤葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體包括質(zhì)子耦聯(lián)葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（proton-coupled folate transporter，PCFT）、還原型葉酸載體（reduced folate carrier，RFC）和葉酸受體（folate receptors，F(xiàn)OLR），它們將葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胎盤細(xì)胞和發(fā)育中的胚胎細(xì)胞中用于細(xì)胞代謝[8]。長(zhǎng)期以來(lái)，葉酸介導(dǎo)的酶基因被認(rèn)為是研究人類NTD遺傳病因的主要候選基因，而調(diào)節(jié)葉酸吸收和將葉酸轉(zhuǎn)變成細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的葉酸載體基因卻并未得到研究者的廣泛關(guān)注。葉酸載體基因主要通過(guò)調(diào)節(jié)葉酸的吸收代謝從而影響人體葉酸濃度。現(xiàn)對(duì)葉酸載體（包括葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及FOLR）基因多態(tài)性與NTD發(fā)病的潛在關(guān)系進(jìn)行綜述，以探討葉酸缺乏和NTD發(fā)病的分子機(jī)制。

1 葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

1.1 SLC46A1被稱為質(zhì)子耦聯(lián)葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體或PCFT，是一種腸道高親和力的葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將葉酸從腸道轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中，編碼該蛋白的基因位于染色體17q11.2[9]。該蛋白分子質(zhì)量為50 ku，有12個(gè)跨膜片段，氨基末端位于細(xì)胞內(nèi)，羧基末端指向細(xì)胞質(zhì)[10]，定位于十二指腸黏膜上皮細(xì)胞的刷狀緣，該部位pH值為5.5，SLC46A1在該部位對(duì)葉酸和N5-甲基四氫葉酸均有很高的親和力，是葉酸的主要吸收部位[11]。此外，SLC46A1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在腎臟、肝臟、胎盤、小腸和脾臟中也有表達(dá)。該基因功能喪失可導(dǎo)致遺傳性葉酸吸收不良（hereditary folate malabsorption，HFM）。HFM是一種以嚴(yán)重的全身和大腦葉酸缺乏為特征的常染色體隱性遺傳性疾病，患者即使在葉酸濃度正常的情況下，其腦脊液葉酸水平仍然很低，這會(huì)對(duì)嬰幼兒的髓鞘形成和大腦發(fā)育產(chǎn)生巨大影響[9]。

VanderMeer等[12]對(duì)愛(ài)爾蘭NTD患者（549例）、NTD患者母親（532例）、NTD患者父親（481例）和無(wú)NTD妊娠史孕婦（999例）進(jìn)行SLC46A1基因檢測(cè)，并通過(guò)基于家庭的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估所選的8個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與發(fā)生NTD風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，結(jié)果顯示，患者攜帶SLC461A rs17719944小c等位基因與NTD風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)（OR=1.29，95%CI：1.00~1.67，P=0.00），該SNP在顯性模型下也表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性（OR=1.3，95%CI：1.05～1.84，P=0.02）。使用乘法模型進(jìn)行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，母親攜帶SLC46A1 rs4795436小g等位基因與降低NTD妊娠風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)（OR=0.62，95%CI：0.39~0.99，P=0.04）。但Zhao等[9]認(rèn)為妊娠期胎兒葉酸吸收為腸外吸收途徑，SLC46A1沒(méi)有參與該過(guò)程，故不會(huì)導(dǎo)致胎兒NTD發(fā)生。但該研究并未考慮母體SLC46A1突變導(dǎo)致的葉酸吸收障礙以及胎盤SLC46A1對(duì)胎兒發(fā)育過(guò)程中葉酸供應(yīng)的影響。目前還需要更多高質(zhì)量的基礎(chǔ)研究來(lái)確定母體和胎盤SLC46A1在人類胚胎葉酸需求方面的作用，并觀察該基因的常見(jiàn)變異是否會(huì)影響其功能。

1.2 SLC19A1被稱為還原葉酸載體或RFC1，定位于21q22.2～q22.3，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，跨度為15 300個(gè)堿基。其編碼2個(gè)交替剪接的mRNA，一個(gè)包含所有7個(gè)外顯子，另一個(gè)不包含第2外顯子，但包含其余6個(gè)外顯子。該基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)已定位到ATG起始密碼子上游約200個(gè)堿基對(duì)的6個(gè)位點(diǎn)。啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有TATA盒序列，但包含1個(gè)共有的Sp1結(jié)合位點(diǎn)[13]。SLC19A1基因編碼一種完整的膜蛋白，這種膜蛋白是一種雙向陰離子交換器，負(fù)責(zé)對(duì)5-甲基四氫葉酸和硫胺素的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，是5-甲基四氫葉酸的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)葉酸進(jìn)入多種細(xì)胞，并維持細(xì)胞內(nèi)葉酸濃度[14]。同時(shí)SLC19A1蛋白也是胚胎發(fā)育過(guò)程中通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸的重要載體[15]。SLC19A1具有多個(gè)SNP，其中有3個(gè)SNP位點(diǎn)（-43T>C，80G>A和696C>T）處于完全連鎖不平衡。SLC19A1-43T>C是轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5′側(cè)翼序列中的一個(gè)SNP，與SLC19A1表達(dá)水平和紅細(xì)胞中葉酸水平低有關(guān)[16]。SLC19A1 696C>T是SLC19A1編碼序列中的另一個(gè)多態(tài)性，但同義突變并不改變氨基酸組成[17]。SLC19A1 80G>A是G等位基因編碼的組氨酸轉(zhuǎn)變成了精氨酸。這種轉(zhuǎn)變損害葉酸從母體血液到胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是NTD的母體危險(xiǎn)因素[17]。Cai等[18]關(guān)于SLC19A1 80G>A多態(tài)性與NTD的研究發(fā)現(xiàn)，母體SLC19A1 80G>A多態(tài)性是子代NTD的危險(xiǎn)因素。Cao等[19]對(duì)中國(guó)北方的152例NTD兒童患者和169例健康兒童的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，2組人群的SLC19A1等位基因和基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.013和0.034），并證實(shí)兒童攜帶G等位基因患NTD的風(fēng)險(xiǎn)更高（OR=1.492，95%CI：1.089~2.044），尤其是G-G-G-T單倍型兒童發(fā)生NTD風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。De Marco等[20]在意大利的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，NTD患兒及其父母G等位基因的頻率增加。Donnan等[21]對(duì)脊柱裂病例進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，SLC19A1 A80G等位基因純合型的母親其子代患有隱性脊柱裂的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=2.55，95%CI：1.07~6.09）。在以后的研究中，需要更大樣本量的臨床研究進(jìn)一步探討SLC19A1的基因多態(tài)性以及該基因與環(huán)境的相互作用與NTD易感性的關(guān)系。

1.3 SLC25A32SLC25A32基因編碼線粒體葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（mitochondrial folic acid transporter，MFT）。MFT定位于線粒體內(nèi)膜[22]，將四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)。THF在線粒體內(nèi)通過(guò)葉酸一碳代謝途徑產(chǎn)生甲酸，甲酸再?gòu)木€粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，為核苷酸生物合成和甲基化反應(yīng)提供必要的一碳單位[6，23-24]。在細(xì)胞質(zhì)葉酸一碳代謝途徑中，至少75%的一碳單位來(lái)自于線粒體[22]，補(bǔ)充甲酸鹽可以預(yù)防78%因SLC25A32基因突變導(dǎo)致的神經(jīng)管閉合障礙，而補(bǔ)充5-甲基四氫葉酸來(lái)預(yù)防該類疾病是無(wú)效的[24]。

目前關(guān)于SLC25A32基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用研究很少。Gao等[25]從美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)下載并收集GSE51285的微陣列數(shù)據(jù)，分析葉酸與NTD的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC25A32與NTD相關(guān)。Kim等[24]建立了一個(gè)缺乏功能性Slc25a32基因的小鼠模型，以研究該基因在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中NTD發(fā)生的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，Slc25a32基因的缺失對(duì)胚胎的影響是致死性的，并導(dǎo)致所有發(fā)育中的小鼠胚胎整個(gè)頭部區(qū)域神經(jīng)管閉合（neural tube closed，NTC）障礙，從而推測(cè)Slc25a32缺失可導(dǎo)致小鼠NTC障礙。很遺憾的是，該研究并沒(méi)有檢測(cè)Slc25a32gt/gt小鼠胚胎的線粒體代謝譜和THF的含量。但補(bǔ)充甲酸鹽可部分改變Slc25a32gt/gt小鼠胚胎的NTD表型，間接表明線粒體中的THF減少[24]。同時(shí)Kim等[24]在美國(guó)和中國(guó)共收集了1 009個(gè)NTD患者的DNA樣本，并對(duì)其進(jìn)行重新測(cè)序，發(fā)現(xiàn)樣本中存在SLC25A32編碼區(qū)雙等位基因功能缺失變體。未來(lái)甲酸鹽很有可能成為臨床醫(yī)師針對(duì)葉酸耐藥性NTD患者母親再次妊娠時(shí)的治療選擇，應(yīng)用前提是早期診斷妊娠胚胎SLC25A32基因缺失。雖然四氫葉酸被認(rèn)為是MFT轉(zhuǎn)運(yùn)的葉酸形式，但目前還沒(méi)有直接證據(jù)證明這一過(guò)程的特異性。因此，對(duì)SLC25A32基因突變的研究也將有助于證實(shí)MFT特異性轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

1.4 FOLH1也叫谷氨酸羧肽酶Ⅱ（glutamate carboxypeptidaseⅡ，GCPⅡ）。該酶主要通過(guò)分解膳食中的聚谷氨酰葉酸，從而調(diào)節(jié)葉酸的吸收。FOLH1的突變基因可能通過(guò)影響GCPⅡ蛋白質(zhì)表面的空間結(jié)構(gòu)和電荷影響其與配體的結(jié)合能力，導(dǎo)致腸道對(duì)膳食葉酸的吸收能力降低[26]。

Vieira等[27]對(duì)NTD患者及其直系親屬的DNA進(jìn)行FOLH1基因多態(tài)性分析，證實(shí)FOLH1 His475Tyr多態(tài)性與血漿葉酸水平升高和同型半胱氨酸濃度降低之間存在關(guān)聯(lián)，且NTD患者母親的FOLH1 His475Tyr突變等位基因頻率較高。該研究還發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的突變，其位于His475Tyr突變體下游的77個(gè)核苷酸，但是該重復(fù)序列是否改變了剪接功能或基因表達(dá)，以及能否通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)來(lái)識(shí)別該重復(fù)序列，從而檢測(cè)His475Tyr突變還需要進(jìn)一步研究。Guo等[26]對(duì)NTD患者母親FOLH1基因多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OLH1基因rs202677多態(tài)性是多發(fā)性NTD（即存在2個(gè)及2個(gè)以上的神經(jīng)管起始部位閉合缺陷[28]）的潛在危險(xiǎn)因素，隱性純合子的孕婦更容易生育多發(fā)性NTD患兒，且NTD的嚴(yán)重程度很可能也與母親FOLH1基因rs202677多態(tài)性有關(guān)[26]。FOLH1基因rs202676 A>G是無(wú)腦兒的潛在危險(xiǎn)因素，該基因突變可能通過(guò)影響神經(jīng)管谷氨酸的釋放和葉酸的吸收而干擾神經(jīng)管的發(fā)育，導(dǎo)致NTD的發(fā)生[26]。FOLH1突變基因是導(dǎo)致NTD發(fā)生的遺傳易感基因[26]。Xie等[29]對(duì)134例NTD患者和156例正常對(duì)照者進(jìn)行rs202676多態(tài)性檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果根據(jù)不同基因型進(jìn)行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOLH1 rs202676 A>G是無(wú)腦畸形的潛在危險(xiǎn)因素。然而，Paul等[30]對(duì)62例NTD患者母親和73例健康嬰兒母親的血樣進(jìn)行FOLH1基因SNP檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)FOLH1基因多態(tài)性rs202676是NTD發(fā)病的保護(hù)因素（OR=0.11，95%CI：0.01～0.86，P=0.006 6）。分析原因可能是受環(huán)境、種族、飲食習(xí)慣等混雜因素的影響，未來(lái)期待更多高質(zhì)量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來(lái)驗(yàn)證FOLH1基因多態(tài)性與NTD的關(guān)系，也期待更多關(guān)于FOLH1基因多態(tài)性與特定類型的NTD的相關(guān)性研究。

2 FOLR

FOLR基因位于染色體11q13.3～q13.5[31]。人類FOLR基因分為FOLR1、FOLR2和FOLR3這3種類型，其中FOLR1和FOLR2編碼糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白，對(duì)葉酸具有高親和力，并通過(guò)內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸，而FOLR3缺乏GPI信號(hào)，是FOLR的分泌形式[9，32]。目前，F(xiàn)OLR1與NTD的相關(guān)性已得到證實(shí)，而FOLR2、FOLR3與NTD的關(guān)系尚未明確[33]。研究表明，脈絡(luò)叢中的FOLR1通過(guò)從脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞釋放含有FOLR1的外泌體，介導(dǎo)5-甲基四氫葉酸從血液到腦脊液的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。FOLR1的表達(dá)主要定位于神經(jīng)褶的最背部（頸部神經(jīng)褶也已檢測(cè)到），并隨著神經(jīng)管閉合而上調(diào)和延長(zhǎng)[33]。FOLR1功能突變會(huì)導(dǎo)致腦脊液中葉酸濃度降低，腦葉酸缺乏，從而導(dǎo)致NTD發(fā)生。

Saitsu[33]對(duì)小鼠Folr1和Folr2基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，基因型為Folr1-/-的小鼠胚胎表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)異常，并在胚胎第10天死亡，但如果懷孕前2周和整個(gè)懷孕期間每天補(bǔ)充高劑量葉酸（25 mg/kg），可顯著降低Folr1-/-小鼠胚胎中的NTD發(fā)生率，而基因型為Folr2-/-小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育正常。Saitsu[33]對(duì)發(fā)育中的胚胎小鼠進(jìn)行Folr1基因的時(shí)間和空間表達(dá)特異性分析，發(fā)現(xiàn)Folr1與前神經(jīng)管閉合密切相關(guān)。通過(guò)lacZ作為報(bào)告載體基因進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)1.1 kb在人與小鼠之間高度保守的增強(qiáng)子序列，推理出人FOLR1基因與人的前神經(jīng)管閉合有關(guān)。Seelan等[32]在研究母鼠Folr1基因型與胚胎發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)，基因型為Folr1-/-母鼠的妊娠胚胎細(xì)胞增殖、凋亡和遷移均受到顯著影響，尤其在葉酸缺乏條件下生長(zhǎng)的腦神經(jīng)嵴細(xì)胞和神經(jīng)管外植體表現(xiàn)出明顯的定向遷移減少。Martin等[34]在對(duì)葉酸缺乏導(dǎo)致NTD的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)上皮細(xì)胞中，F(xiàn)OLR1介導(dǎo)了葉酸的攝取，并觸發(fā)肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）的激活和磷酸化，促進(jìn)頂端收縮和胚胎神經(jīng)上皮的形態(tài)發(fā)生改變，從而預(yù)防NTD。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

到目前為止，研究人員仍在不懈努力，試圖找到葉酸降低NTD發(fā)生的機(jī)制，并開(kāi)發(fā)新的治療策略來(lái)預(yù)防復(fù)雜性葉酸耐藥型NTD的發(fā)生。在敲除葉酸載體蛋白基因的動(dòng)物模型中，即使不給予缺乏葉酸的飲食干預(yù)措施，NTD仍是常見(jiàn)的發(fā)育結(jié)果[24]。葉酸載體基因多態(tài)性的相關(guān)研究結(jié)果將為有NTD病史或NTD家族史母親的再次妊娠提供新的臨床決策，并將為新的診斷標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)提供希望。

近年來(lái)，關(guān)于葉酸載體基因多態(tài)性對(duì)NTD的潛在影響已進(jìn)行了大量研究，但大部分集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，缺乏高質(zhì)量的臨床對(duì)照研究。由于研究的樣本量較少，導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不準(zhǔn)確，需要大樣本多中心的臨床研究來(lái)驗(yàn)證結(jié)論的可靠性；另外，對(duì)不同種群的研究得出了相互矛盾的結(jié)論，說(shuō)明在葉酸載體基因多態(tài)性上存在種族連鎖不平衡可能；多個(gè)協(xié)同作用基因之間的相互影響、相互作用對(duì)于全面研究它們?cè)贜TD發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義，這些問(wèn)題也是目前研究的難點(diǎn)[35]。另外，葉酸載體基因多態(tài)性與特定類型NTD之間的聯(lián)系尚未明確，目前僅觀察到葉酸載體蛋白均存在時(shí)間、空間特異性，在不同時(shí)間和組織中其分布量和活性均不同。在未來(lái)的研究中，研究者們可以通過(guò)組織特異性與基因多態(tài)性及特定類型NTD進(jìn)行相關(guān)性分層分析，進(jìn)一步尋找NTD的發(fā)病機(jī)制。