富血小板血漿治療薄型子宮內(nèi)膜的作用機(jī)制

鄭秀丹，尹蘭蘭，王艷波，馬天仲

在輔助生殖技術(shù)（assistedreproductive techniques，ART）周期中，成功的著床和分娩取決于子宮內(nèi)膜的接受能力和胚胎的侵入能力，子宮內(nèi)膜成熟發(fā)育的特異性和精確性對(duì)胚胎著床和隨后的生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用。評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性對(duì)ART至關(guān)重要，而子宮內(nèi)膜厚度可以作為一個(gè)無創(chuàng)參數(shù)來推斷子宮內(nèi)膜的容受性[1]。體外受精（in vitro fertilization，IVF）患者中薄型子宮內(nèi)膜者占1%～2.5%[2]。子宮內(nèi)膜過薄可導(dǎo)致反復(fù)種植失敗、體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療周期取消，甚至可能增加妊娠成功后子癇前期、胎盤早剝和小于胎齡兒（SGA）等產(chǎn)科妊娠并發(fā)癥的患病風(fēng)險(xiǎn)[3]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）作為薄型子宮內(nèi)膜的新型治療方法，其確切的作用機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)就PRP對(duì)薄型子宮內(nèi)膜的治療現(xiàn)狀以及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 薄型子宮內(nèi)膜概述

目前對(duì)于薄型子宮內(nèi)膜的定義尚未達(dá)成共識(shí)。Liu等[4]的研究表明，在新鮮胚胎移植周期（24 363個(gè)）中子宮內(nèi)膜厚度低于8 mm、凍融胚胎移植周期（20 114個(gè)）中子宮內(nèi)膜厚度低于7 mm時(shí)，臨床妊娠率和活產(chǎn)率都會(huì)下降。中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)在2018年發(fā)表的《輔助生殖技術(shù)中異常子宮內(nèi)膜診療的中國(guó)專家共識(shí)》推薦，在ART中子宮內(nèi)膜厚度＜7 mm時(shí)稱為薄型子宮內(nèi)膜，但不建議僅依據(jù)子宮內(nèi)膜厚度來評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性、預(yù)測(cè)ART妊娠結(jié)局或取消胚胎移植周期[5]。同樣，Kasius等[6]進(jìn)行的一項(xiàng)對(duì)IVF患者子宮內(nèi)膜厚度和妊娠率的系統(tǒng)回顧和薈萃分析也不建議僅僅因?yàn)楸⌒妥訉m內(nèi)膜而取消IVF治療周期。

薄型子宮內(nèi)膜可能是由多種原因和疾病引起的，其中使用口服避孕藥（oral contraceptive，OC）或促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑等藥物可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜菲薄，但停用藥物后多可恢復(fù)正常；而因反復(fù)宮腔操作、子宮動(dòng)脈栓塞術(shù)、子宮內(nèi)膜結(jié)核、宮腔感染和子宮內(nèi)膜炎等造成的子宮內(nèi)膜損傷以及子宮肌層病變引起的內(nèi)膜菲薄，往往會(huì)形成反復(fù)頑固型薄型子宮內(nèi)膜；此外，原因不明的薄型子宮內(nèi)膜也并不少見[7]。

對(duì)于薄型子宮內(nèi)膜患者，許多藥物用于提高子宮內(nèi)膜厚度和胚胎著床率，如雌激素、促性腺激素、來曲唑、枸櫞酸西地那非、己酮可可堿、維生素E和他莫西芬等，但療效有限，薄型子宮內(nèi)膜仍是一個(gè)困擾臨床的重要問題。近年來，干細(xì)胞治療和宮腔局部藥物灌注治療已成為薄型子宮內(nèi)膜治療的研究熱點(diǎn)，而PRP灌注治療因能提供超過生理劑量的必要生長(zhǎng)因子，可為愈合潛力低的組織修復(fù)提供再生刺激，而成為一種安全性顯著的替代方法[8]。

2 PRP概述

PRP為自體周圍靜脈血經(jīng)細(xì)胞分離，采用血小板分離液和密度梯度離心法分離提取得到的濃縮血小板血漿。在過去10年中，PRP應(yīng)用的自體細(xì)胞療法已在多種疾病治療中發(fā)揮輔助作用，同時(shí)在各種婦科疾病中的應(yīng)用也有了新進(jìn)展，如外陰營(yíng)養(yǎng)不良癥、外陰癌重建手術(shù)、卵巢早衰、卵巢扭轉(zhuǎn)、難治性子宮內(nèi)膜異位癥和反復(fù)種植失敗等。PRP在薄型子宮內(nèi)膜治療中的確切作用較為復(fù)雜，學(xué)者們提出了以下幾種可能的機(jī)制[9]：①通過多種生長(zhǎng)因子[包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅠ（transforming growth factoβⅠ，TGF-βⅠ）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfactor，EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）]以及刺激多種趨化因子[如CXC細(xì)胞趨化因子配體5（CXCcellchemokine ligand 5，CXCL5）、CXCL12]的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞再生、增殖和血管化；②活化的PRP促進(jìn)了人類子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的遷移，如經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞（menstrual blood stem/stromal cell，MenSC）、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（endometrial mesenchymal stem cell，eMSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）等；③通過化學(xué)吸引作用遷移細(xì)胞，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化；④通過刺激血小板源生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）/磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路來增加旁分泌因子的水平，減緩細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)細(xì)胞再生功能[10]。

2.1 生長(zhǎng)因子現(xiàn)今PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的機(jī)制尚未完全闡明，實(shí)驗(yàn)室研究表明PRP中高濃度的生長(zhǎng)因子可以潛在地加速愈合過程，且PRP優(yōu)于重組人生長(zhǎng)因子，因?yàn)檠“寮せ羁舍尫哦喾N生長(zhǎng)因子和分化因子[11]。VEGF、PDGF、TGF-βⅠ、EGF、IGF-1、HGF存在于血小板α-顆粒中，PRP被激活后加速血小板中生長(zhǎng)因子的釋放，不同制備方法獲得的PRP中生長(zhǎng)因子的數(shù)量存在顯著差異，這些差異可能與白細(xì)胞的濃度或其產(chǎn)生的因子有關(guān)，PRP中白細(xì)胞濃度越高，其具有的VEGF、HGF、IGF-1和PDGF-AB濃度越高[12]。已有研究表明，一些生長(zhǎng)因子可控制子宮內(nèi)膜的增殖，例如PDGF能顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮的增殖、遷移和管狀形成[13]；在人類、小鼠和大鼠的子宮內(nèi)膜中都存在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（cmesenchymal-epithelia transition factor，c-MET）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），這些生長(zhǎng)因子受體與配體結(jié)合時(shí)通過觸發(fā)多種信號(hào)通路，控制細(xì)胞從G0期過渡到G1期和從G1期過渡到S期的速度，導(dǎo)致上皮細(xì)胞存活和增殖[14]。同時(shí)血小板α-顆粒中也含有不同的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和趨化因子等，能夠刺激細(xì)胞趨化和成熟的炎癥介質(zhì)。趨化因子在子宮內(nèi)膜的生成已經(jīng)得到了充分研究，例如子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在其他細(xì)胞因子的刺激下產(chǎn)生CXCL5，而CXCL5作為炎癥介質(zhì)可增加單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，在控制炎癥過程中可能產(chǎn)生有益作用[15]。另外一項(xiàng)對(duì)薄型子宮內(nèi)膜模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，使用CXCL12處理的小鼠子宮內(nèi)膜上皮面積顯著增加，Ki-67和CD31的免疫反應(yīng)性顯著升高，且子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、IL-1β和 整 合 素β3（integrin β3）的mRNA表達(dá)水平均升高，證明CXCL12可改善小鼠較薄子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，并增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和腺體數(shù)量[16]。

2.2 子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞人類子宮內(nèi)膜的獨(dú)特之處在于能夠周期性地快速自我再生，子宮內(nèi)膜基底層可作為產(chǎn)生新功能層的祖細(xì)胞來源，有證據(jù)表明子宮內(nèi)膜-子宮肌層邊界附近的基底層以及功能性層中存在多個(gè)譜系受限的干/祖細(xì)胞群[17]，而子宮內(nèi)膜的干/祖細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的再生功能是必要的。Kaitu′u-Lino等[18]采用了標(biāo)記滯留細(xì)胞（label-retaining cell，LRC）技術(shù)，如使用DNA合成標(biāo)志物溴脫氧尿苷（BrdU）對(duì)基質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行脈沖標(biāo)記，在1個(gè)有功能的子宮內(nèi)膜破裂和修復(fù)的小鼠模型中檢測(cè)子宮內(nèi)膜脈管系統(tǒng)的候選間質(zhì)干/祖細(xì)胞。結(jié)果顯示，在小鼠子宮內(nèi)膜修復(fù)過程中LRC與血管系統(tǒng)相關(guān)的比例明顯高于蛻膜前，其中一部分的LRC正在增殖，表明血管周圍的LRC可能在子宮內(nèi)膜的廣泛重構(gòu)中促進(jìn)了子宮內(nèi)膜間質(zhì)擴(kuò)張，證實(shí)了伴隨著子宮內(nèi)膜破裂和修復(fù)的血管變化，有一群干/祖細(xì)胞參與了子宮內(nèi)膜間質(zhì)的增殖和擴(kuò)張。eMSC可以重建子宮內(nèi)膜組織，增加子宮內(nèi)膜厚度，在促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)和功能方面發(fā)揮著重要作用。而BMSC也可促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生[19]。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)PRP可以促進(jìn)eMSC的增殖和遷移，使其向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化，且PRP以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移，在2%的PRP劑量時(shí)eMSC的增殖達(dá)到最大值。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，在宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）小鼠模型中MenSC和PRP的聯(lián)合移植能夠更有效地促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，妊娠率顯著提高[21]。這些研究證明PRP治療可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的效應(yīng)。

2.3 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）/間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymalepithelial transition，MET）EMT/MET在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤背景下備受關(guān)注，在胚胎發(fā)育中，胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）可通過EMT和MET向體細(xì)胞類型分化。分化的體細(xì)胞也可以通過連續(xù)的EMT-MET被重新編程為多能細(xì)胞，MET是獲得多能性的關(guān)鍵步驟，但EMT也可能同步并啟動(dòng)細(xì)胞重新編程[22]。如今越來越多的研究表明子宮內(nèi)膜之間的間充質(zhì)和上皮細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換在其正常生理功能中起關(guān)鍵作用，Huang等[23]利用雙轉(zhuǎn)基因模型證明，在子宮內(nèi)膜損傷后，上皮祖細(xì)胞繼續(xù)只存在于上皮間室，而基質(zhì)祖細(xì)胞可分化為基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，證實(shí)了MET在損傷后子宮內(nèi)膜再生中的作用。Cousins等[24]利用小鼠月經(jīng)樣模型來確定MET在子宮內(nèi)膜再生中的作用，在人工蛻膜化和停用孕酮后，檢測(cè)到了上皮和基質(zhì)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)的標(biāo)志物，并且隨著時(shí)間的推移似乎更靠近上皮恢復(fù)區(qū)域的基質(zhì)細(xì)胞群。在孕酮停藥和子宮內(nèi)膜變性24 h內(nèi)，間質(zhì)標(biāo)志物（如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、Wnt4）的mRNA表達(dá)顯著下降，而上皮標(biāo)志物[如角蛋白18（Krt18）、E-鈣黏蛋白、Wnt7a]的mRNA表達(dá)顯著增加，這表明了潛在的MET過程。2020年Agarwal等[25]的研究顯示，宮腔灌注PRP后，32例患者中有24例子宮內(nèi)膜增加至7 mm或更厚，這24例患者后續(xù)都接受了凍融胚胎移植，有12例患者妊娠，其中10例臨床妊娠，2例生化妊娠，該研究表明在宮腔鏡引導(dǎo)下將PRP注射到子宮內(nèi)膜-子宮肌層連接處可改善薄型子宮內(nèi)膜患者的內(nèi)膜厚度。另外一項(xiàng)體外研究表明，活化的血小板促進(jìn)BMSC、人子宮內(nèi)膜eMSC和子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞（Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell，IC）等子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和遷移，但沒有發(fā)現(xiàn)促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞或eMSC的MET，這是體外和體內(nèi)結(jié)果預(yù)期的差異，需要進(jìn)一步的研究[26]。

2.4 NF-κB信號(hào)通路NF-κB是一種存在于多種類型細(xì)胞中的重要核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB肽由5個(gè)亞基組成二聚體，包括RelB、c-Rel、p65（RelA）、p50/p105（NF-κB1）和p52/p100（NF-κB2）。這些亞單位可結(jié)合形成不同的二聚體，通過與NF-κB抑制蛋白I-κB結(jié)合而保持活性。NF-κB典型通路是由促炎性因子刺激脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或IL-1誘導(dǎo)的，激活I(lǐng)-κB激酶復(fù)合物（I-κB kinase，IKK），磷酸化I-κB，并導(dǎo)致p50/p65激活，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞生存的基因轉(zhuǎn)錄[27]。NF-κB及其不同的激活途徑和二聚體在子宮內(nèi)膜生理學(xué)中的作用尚待闡明，但根據(jù)其已知的功能，NF-κB可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜炎癥、免疫、細(xì)胞凋亡、黏附、侵襲和血管生成，NF-κBDNA結(jié)合活性存在于健康女性月經(jīng)周期的所有階段，在整個(gè)月經(jīng)周期，子宮內(nèi)膜中NF-κB-DNA的總結(jié)合是結(jié)構(gòu)性的和可變的[28]，其p50和p65亞單位、I-κB和IKK在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)和上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在健康女性增殖期子宮內(nèi)膜中p65-DNA結(jié)合高于分泌期和月經(jīng)期子宮內(nèi)膜，增殖期子宮內(nèi)膜中p65-DNA結(jié)合的增強(qiáng)可以使月經(jīng)周期排卵前子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖增加和凋亡減少[29]，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜凋亡對(duì)月經(jīng)周期組織穩(wěn)態(tài)和組織重塑有重要作用，從而為胚胎的著床做好子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。還有研究表明，在體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥基質(zhì)細(xì)胞（eutopic endometrial stromal cell，EESC）以及人月經(jīng)子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型中，抑制NF-κB信號(hào)通路可通過減少細(xì)胞增殖和增加子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞凋亡來抑制子宮內(nèi)膜異位癥病變的進(jìn)展[30]。Zhou等[31]使用PRP（5 000計(jì)數(shù)/mL）與BMSC浸泡明膠支架，將其縫合于子宮角損傷的大鼠模型中。研究發(fā)現(xiàn)PRP治療可提高再生子宮內(nèi)膜組織和培養(yǎng)的BMSC中IL-10的表達(dá)，增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三系分化潛能。但是抑制和沉默BMSC的p50可抑制PRP誘導(dǎo)的IL-10的表達(dá)和分泌，p50能夠直接結(jié)合IL-10啟動(dòng)子并促進(jìn)其表達(dá)。這表明PRP治療改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后大鼠子宮角損傷的子宮內(nèi)膜再生的工作模型，可能是通過NF-κB信號(hào)通路亞基p50介導(dǎo)，直接誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)和產(chǎn)生。這進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。

3 PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的臨床進(jìn)展

2015年，Chang等[32]進(jìn)行了首次臨床試驗(yàn)，通過宮腔灌注PRP來增加接受IVF治療患者的子宮內(nèi)膜厚度。該研究中的5例患者在接受標(biāo)準(zhǔn)激素替代治療后子宮內(nèi)膜反應(yīng)較差，給予PRP宮內(nèi)輸注，每個(gè)周期1～2次。5例患者的子宮內(nèi)膜厚度增加1.1～1.6 mm（治療后均≥7 mm），4例患者成功妊娠，證明PRP可改善妊娠結(jié)局。隨后也有一些臨床研究發(fā)現(xiàn)自體PRP可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，改善妊娠結(jié)局[20，33]。但是這些研究存在樣本量小，缺少隨機(jī)對(duì)照等局限性。為了比較不同來源的PRP對(duì)不孕癥子宮內(nèi)膜病變的治療效果，de Miguel-Gómez等[34]抽取了4例Asherman綜合征/子宮內(nèi)膜萎縮患者以及1例正常生育期婦女的血漿，分別運(yùn)用在子宮損傷NOD/SCID小鼠模型和體外子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型中，結(jié)果顯示所有的血漿樣本都含有具有高再生潛力的分子，體外細(xì)胞增殖率和遷移率升高，損傷的小鼠子宮組織促再生標(biāo)志物Ki-67和HOXA10升高，Asherman綜合征/子宮內(nèi)膜萎縮患者的血漿與健康女性并無不同，其所提取出的PRP均具有可用于子宮內(nèi)膜病變的再生特性。Tehraninejad等[35]招募了85例子宮內(nèi)膜厚度正常（≥7 mm）但有反復(fù)種植失敗史的患者，在患者充分知情同意后根據(jù)患者的意愿將其分為干預(yù)組（PRP，42例）和對(duì)照組（拒絕PRP治療，43例），所有患者均接受激素替代治療。2組的妊娠結(jié)局包括生化妊娠率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率（≥20周）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（35.7%vs.37.2%，P=0.89；31.0%vs.37.2%，P=0.54；26.8%vs.25.6%，P=0.90），從而推測(cè)PRP對(duì)于接受胚胎移植的子宮內(nèi)膜厚度正常的反復(fù)種植失敗患者來說并不是一種有效的輔助治療方法。目前許多關(guān)于PRP的研究樣本量較小，研究設(shè)計(jì)也不盡相同。關(guān)于PRP是否被推薦為臨床常規(guī)治療，尚需進(jìn)一步進(jìn)行高質(zhì)量的大型前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，并確定哪些女性將從PRP中獲益最多。

4 結(jié)語和展望

PRP作為新興的薄型子宮內(nèi)膜患者子宮內(nèi)膜制備的輔助方法，其影響子宮內(nèi)膜再生的作用機(jī)制還未完全被揭示，現(xiàn)階段的研究多與PRP內(nèi)生長(zhǎng)因子通過促進(jìn)組織壞死消退和趨化，細(xì)胞再生、增殖和遷移，細(xì)胞外基質(zhì)合成、重構(gòu)，血管生成和上皮化等作用有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步研究PRP治療的分子基礎(chǔ)，以揭示其確切的機(jī)制，并為PRP對(duì)子宮內(nèi)膜各病理生理的有益作用獲得更確鑿的證據(jù)，同時(shí)也降低其可能帶來的潛在危險(xiǎn)以確保PRP治療的安全性。