胚胎早期發(fā)育過程中主要信號通路的作用機制

陳然然，宋殿榮

輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）已在臨床廣泛開展，但與ART相關的低成功率和高畸形率一直是困擾臨床的難題。針對該現象目前主要從引進新興技術和優(yōu)化操作方法等方面著手，但往往收效有限。人類胚胎發(fā)育是一個極其復雜的生命過程，對該過程認識的局限性導致針對胚胎發(fā)育分子水平的調控與治療發(fā)展緩慢。由于不同物種間胚胎早期發(fā)育的分子機制具有高度的保守性，因此，通過小鼠、斑馬魚等模型動物可以在一定程度上了解人類胚胎早期發(fā)育的分子變化。現綜述不同信號通路在胚胎早期發(fā)育過程中的作用，旨在為ART中提高胚胎種植率和改善妊娠結局的分子干預相關研究提供理論參考和研究思路。

1 Hippo信號通路

在小鼠胚胎發(fā)育過程中，第一次細胞譜系分離發(fā)生在桑葚胚和囊胚階段之間，即胚胎植入前。8細胞晚期，隨著致密化的開始各個卵裂球出現最初的極性變化，至桑葚胚期（16～32細胞期），外部細胞均獲得了頂端－基底極性，并分化為一種囊狀上皮組織，即滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）。TE細胞在植入過程中必不可少，將來參與形成絨毛膜，進一步發(fā)育成胎盤。內部細胞是非極性細胞，集中于囊胚的一側形成內細胞群（inner cell mass，ICM），ICM將發(fā)育成為胚胎體和一些胚外組織[1]。Hippo信號通路在ICM中激活，在TE中失活，這種位置依賴性的激活與失活促進了不同細胞的發(fā)育命運，在第一次譜系分離中起核心作用[2]。

在哺乳動物中，Hippo信號通路的核心成分有MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1，YAP為該通路下游的主要效應分子。當Hippo信號通路被抑制時，YAP可被轉運至細胞核內與轉錄因子如TEAD4結合，促進Cdx2、Gata3等TE特異性基因的轉錄，從而使細胞分化為TE譜系。相反，當Hippo通路激活時，由于YAP在細胞質中被降解，細胞核中無法形成TEAD-YAP復合物，從而導致Sox2、Oct4基因轉錄增加，促進ICM譜系的形成。

Sasaki等[3]研究發(fā)現，由E鈣黏蛋白（E-cadherin）介導的細胞間黏附和Par-aPKC（partition-defectiveatypical protein kinase）系統(tǒng)介導的細胞極化是導致Hippo信號通路在ICM和TE中差異性激活的根本原因，缺乏TEAD4的胚胎無法表達Cdx2基因，從而不能發(fā)育產生TE[4]。當然，過度表達LATS2激酶（Hippo的激活劑）會使外部細胞中Cdx2的轉錄降低，而抑制LATS1和LATS2的活性，導致Cdx2基因在內部細胞中的異常表達[5]?？梢奌ippo信號通路相關分子的正常表達是胚胎進一步發(fā)育的前提。

2 成纖維細胞生長因子/細胞外信號調節(jié)激酶（fibroblast growth factor/extracellular signalregulated kinase，FGF/ERK）信號通路

ICM細胞根據內化的時間不同產生了單個細胞之間的異質性，早期內化的細胞表達更高水平的FGF4配體，而后期內化的細胞表現出更高水平的FGF受體1（FGFR1）和FGFR2。分泌的FGF4配體激活表達FGFR1和FGFR2的細胞中的FGF/ERK信號，導致了Gata6基因和Nanog基因在細胞間的差異性表達。表達Gata6基因的細胞最終發(fā)育為原始內胚層（primitive endoderm，PE），表達Nanog基因的細胞最終發(fā)育為外胚層（epiblast，EPI），即第二次譜系分離[6]。因此，FGF/ERK通路在第二次譜系分離中發(fā)揮了重要作用。

脊椎動物的FGF4開始表達于8～16細胞期的桑葚胚，在ICM中僅存在于EPI中，并且表達水平受多能因子OCT4和SOX2的直接調控。相反，其受體FGFR2的表達主要局限于胚胎外譜系，如TE和PE。FGF通過旁分泌的方式作用于FGFR，最終導致ERK通過加速纖維肉瘤（RAF）/絲裂素活化蛋白激酶激酶（MEK)/ERK信號通路活化和核易位，原始內胚層標記基因如Gata6的表達。未接受FGF/ERK信號的細胞則表達Nanog，從而導致了EPI和PE譜系的分離。

研究顯示，在ICM形成早期，所有細胞共同表達兩個譜系的標記基因Nanog和Gata6，隨后這些細胞逐漸上調其中一個因子的表達，同時下調另一個因子的表達，直到兩種因子在所有細胞中互斥表達[7-8]。該信號通路的完全阻斷會導致所有的ICM細胞變成NANOG陽性的EPI細胞，相反，FGF/ERK通路的過度激活會導致所有的ICM細胞變成GATA6陽性的PE細胞[9-12]。除了在胚胎第二次譜系分離中的作用，FGF/ERK信號是胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）從連續(xù)增殖中退出并啟動分化所必需的[13]。Kunath等[14]發(fā)現FGF4缺失的ESC在未分化狀態(tài)下表現正常，但經誘導后無法形成神經外胚層和中胚層，添加外源性FGF4因子后其向神經細胞的分化能力恢復。

可見，EPI細胞表達FGF4，FGF4以旁分泌方式作用于PE細胞導致了第二次譜系分離。同時，FGF4又以自分泌的方式驅動EPI細胞退出多能狀態(tài)，確保胚胎正常分化。因此，為了使ESC具有最佳的增殖能力和多能性，FGF/ERK信號必須控制在一定的閾值以下，相反，在分化過程中，FGF/ERK信號需要被有效激活，以使ESC對譜系誘導產生反應。因此，FGF/ERK信號通路相關分子的表達水平和通路的激活狀態(tài)對ESC的增殖和分化至關重要。

3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路

小鼠囊胚于受精后第4天植入子宮，并伴隨著一系列的形態(tài)變化形成細長的卵筒結構。在這個轉變過程中EPI細胞必須保持其干細胞特性，若在關鍵階段干細胞特性受損使胚胎過早分化，可導致胚胎譜系分化紊亂和組織發(fā)育缺陷。研究發(fā)現，BMP信號通路在維持EPI多能性，防止其向神經組織分化的過程中發(fā)揮了重要作用。另外，BMP信號通路在胚胎發(fā)育早期背-腹軸的建立中亦發(fā)揮重要作用。

BMP屬于轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，在胚胎發(fā)育過程中通過保守的BMP/Smad信號通路發(fā)揮功能。在小鼠中，雖然已經鑒定出大量的BMP，但只有BMP2和BMP4在早期胚胎發(fā)育中起作用，植入后BMP受體1A（BMP receptor 1A，BMPR1A）在EPI中的普遍表達使其成為該時期BMP作用的主要受體。BMP首先與細胞膜上特異的BMPR1和BMPR2結合形成受體復合物，隨后活化的BMPR1磷酸化并激活受體調控型Smad蛋白（R-Smad，包括Smad1/5/8），激活后的R-Smad和輔助型Smad蛋白（Co-Smad，包括Smad4）結合形成轉錄復合物，進入核內與轉錄因子相互作用調節(jié)靶基因的轉錄[15]。

BMP信號通路在胚胎細胞多能性的維持中有重要作用，雖然BMP信號通路相關分子突變的胚胎能夠發(fā)育到植入后階段，但是它們表現出嚴重的發(fā)育異常，不能形成原腸胚，并在受精后第8.5天（embryonic day 8.5，E8.5）左右死亡[16]。Bmpr1a-/-或Bmpr1a突變體胚胎表現為過早分化，多能性基因Oct4、Nanog等表達下調或缺失，早期神經標記基因異位表達，且存在細胞增殖缺陷[17]。BMP信號通路對胚胎背-腹軸的建立亦十分關鍵，其是重要的腹部細胞命運誘導因子。在囊胚晚期和原腸胚早期，BMP信號下游的活性因子磷酸Smad1/5/8（p-Smad1/5/8），由腹部至背部呈現由高到低的濃度梯度分布，起著形態(tài)素的作用[18]。

4 Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路

胚軸的形成又稱胚胎極性的確立，是胚胎發(fā)育在三維空間上不對稱結構的發(fā)生過程，也是在發(fā)育早期，要求胚胎中每個細胞都能明確其自身相對于其他細胞所處位置的過程。發(fā)育過程中形成3個胚軸，即前-后軸、背-腹軸和左-右軸。胚軸一旦形成，每個細胞在胚胎中的位置即可根據胚軸進行準確定義。其中經典Wnt信號通路的激活對胚軸建立的轉錄調控至關重要。

Wnt信號通路是一個復雜的調控網絡，包括經典Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路，這里主要介紹由β-catenin介導的經典信號通路。該通路在多種物種間高度保守，其特點為Wnt配體與受體的結合導致細胞質蛋白β-catenin進入細胞核激活靶基因表達，主要參與細胞增殖和遷移等過程。

盡管在植入前的小鼠胚胎中可以檢測到多種Wnt配體、受體和相關調節(jié)因子，但越來越多的證據表明經典Wnt信號通路對于囊胚形成階段的胚胎并非必要[19]。但在胚軸的形成過程中Wnt信號通路必不可少，母源Wnt/β-catenin信號通過下游β-catenin誘導了組織中心的形成，建立了胚胎的背-腹軸，βcatenin基因敲除的小鼠胚胎往往在植入后早期死亡，并伴隨著前-后軸形成缺陷、中胚層和頭部結構的缺失等[20]。Wnt信號在胚胎發(fā)育的不同階段對胚層的誘導作用不同。背部積累的母源β-catenin能激活Nodal信號通路并與之協(xié)同作用誘導背部中胚層和內胚層的發(fā)育，原腸期合子表達的Wnt信號則促進了胚胎后部、腹部中胚層的形成以及前-后軸線的建立[21-22]，Wnt/β-catenin信號通路還可以通過調控叉頭盒j1基因（forkhead box j1，Foxj1）的正常功能在左-右軸的建立方面起作用[23]?？梢姡琖nt信號通路參與了胚胎早期發(fā)育的多重事件，發(fā)揮著廣泛地調節(jié)作用。

5 Notch信號通路

Notch信號通路是一種進化上保守的信號系統(tǒng)，在胚胎細胞譜系分離的多個步驟中控制細胞命運的選擇。研究發(fā)現，在胚胎發(fā)育早期，Notch信號通路在促進TE形成，調節(jié)三胚層分化和產生左右不對稱性方面發(fā)揮了重要作用。

Notch通過配體/受體相互作用激活跨膜Notch受體，導致受體胞內片段（notch intracellular domain，NICD）易位入核，繼而調節(jié)下游靶基因的表達。研究發(fā)現Notch信號通路的關鍵分子Rbpsuh敲除的胚胎能夠發(fā)育成囊胚并正常植入，但在原腸胚期死亡，伴隨著體細胞生成、神經生成、血管生成和心臟生成方面的嚴重缺陷，表明在植入前發(fā)育過程中Notch信號通路是非必需的，但在胚層分化中必不可少[24]。研究表明，Notch通路的激活可以促進前神經細胞的發(fā)育，抑制心肌細胞的分化。在ESC神經誘導第3天短時間激活Notch信號通路，可使細胞周期蛋白D1（cyclinD1）的表達增加，細胞增殖加快，促進神經系統(tǒng)的分化[25-26]。而Notch信號通路激活的細胞早期心臟發(fā)育標記基因Brachyury和FGF-8的表達明顯降低，不能完成心肌細胞的分化。此外，如前所述，Hippo信號通路的差異性激活和失活導致了第一次譜系分離，最近的研究表明第一次譜系分離是Hippo信號通路和Notch信號通路共同作用的結果，過度激活Notch信號通路可使位于內部的細胞定位到外部進而分化為TE譜系[27]。該研究發(fā)現了Notch信號通路在胚胎第一次譜系分化中的作用，為胚胎早期分化的機制研究提供新思路。

6 Nodal信號通路

脊椎動物胚胎發(fā)生過程中最重要的事件之一是三個胚層的形成，經過一系列的快速分裂，胚胎在囊胚后期和原腸胚早期形成了中胚層和外胚層。中胚層進一步分化為中胚層和內胚層。最終外胚層發(fā)育成皮膚和神經系統(tǒng)，中胚層產生心臟、肌肉、腎臟、骨骼、血管和造血系統(tǒng)，內胚層可分化為消化器官和呼吸器官。中胚層的誘導受到嚴格的調控，其中Nodal信號通路是中胚層分化最重要的誘導因子。另外，Nodal信號通路還參與了胚層左右不對稱發(fā)育以及神經的發(fā)生與命運決定等諸多過程。

Nodal是TGF-β超家族的一類成員，能與Ⅰ型和Ⅱ型的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體結合，通過下游的效應分子Smad2/Smad3進一步轉導信號，調節(jié)目的基因的轉錄。研究表明，胚胎原結中纖毛的定向擺動引起了Nodal分子向左側流動，隨后Nodal激活中線上Lefty1和側板中胚層中Lefty2的表達，Lefty1主要起到“屏障”作用，阻斷Nodal向右側擴散，將特異性不對稱信號限制在左側板中胚層，Lefty2在左側板中胚層中特異性表達，為左右不對稱性建立的分子基礎[28-30]。此外，Nodal信號分子在不同的濃度對中胚層和內胚層的誘導有不同作用，高濃度時通過激活Mixer和Gata5的表達促進內胚層的發(fā)育，低濃度時通過促進FGF配體以及Brachyury的表達誘導中胚層的形成[31-35]。因此，Nodal信號通路功能的正常發(fā)揮對胚胎的正常發(fā)育有重要意義。

7 結語

胚胎發(fā)育是一個極其復雜的過程，不同信號通路既相互作用又功能獨特，不同分子按照特定的時空順序表達和消失是保證胚胎細胞正常增殖和分化的關鍵，任何一種信號通路都無法單獨完成胚胎的發(fā)育調控，如Hippo信號通路在ICM中激活，TE中失活，而Notch信號通路在ICM中失活，TE中激活，這種相反的表達模式導致了第一次譜系分離的正常發(fā)生[27]。LIF通路和BMP通路的激活共同維持著ESC的多能性和增殖能力，而Nodal和Wnt信號通路的激活啟動了ESC的分化，從而使胚胎的增殖和分化協(xié)調有序進行[36]。因此，對胚胎發(fā)育的研究應充分考慮眾多母源因子及復雜信號網絡之間的相互調控，這對深入理解不同信號通路間的相互作用具有重要意義。