微小RNA在子宮內(nèi)膜蛻膜化中的功能

李洪菀菀，楊潔瓊，張叢

子宮內(nèi)膜蛻膜化廣義上是指月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜在排卵期后發(fā)生的一系列變化，包括子宮腺體的分泌轉(zhuǎn)化、特異性子宮自然殺傷細(xì)胞的流入和血管重塑等。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cell，ESC）是子宮內(nèi)膜中主要的細(xì)胞類型。ESC在蛻膜化過程中轉(zhuǎn)化為分泌型的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，是蛻膜化過程中最主要的改變。狹義上的蛻膜化僅指ESC的形態(tài)改變和生化重編程[1]。不同于大多數(shù)哺乳動(dòng)物，人類的蛻膜化過程不依賴于胚胎著床，是月經(jīng)周期中的自發(fā)性過程，由排卵后孕酮水平上升和局部環(huán)磷酸腺苷生成驅(qū)動(dòng)。孕酮和環(huán)磷酸腺苷通路在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平的調(diào)控使蛻膜基質(zhì)細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，抵抗炎癥和氧化損傷，抑制局部母體免疫反應(yīng)，為胚胎著床和維持妊娠做好準(zhǔn)備[2]。若無胚胎著床，蛻膜化的內(nèi)膜剝脫導(dǎo)致月經(jīng)發(fā)生和子宮內(nèi)膜周期性再生[3]。蛻膜化在妊娠和月經(jīng)周期中具有重要作用，蛻膜化不良與反復(fù)種植失敗、子宮內(nèi)膜異位癥和子癇前期等多種女性疾病的發(fā)生有關(guān)，嚴(yán)重?fù)p害女性健康。

大量相關(guān)研究相繼發(fā)現(xiàn)，許多分子參與了蛻膜化過程，并在子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎著床過程中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用。蛻膜特異性分子標(biāo)志因物種而異，人類的蛻膜標(biāo)志分子主要包括催乳素（prolactin，PRL）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor-binding protein 1，IGFBP1）等。這一系列細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜蛻膜化的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。近期眾多研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）能夠通過對(duì)蛻膜化關(guān)鍵基因的作用調(diào)控蛻膜化，一些miRNA表達(dá)的改變與蛻膜化受損所致的疾病有關(guān)。miRNA在多種體液中存在，可能作為疾病診斷和預(yù)后的標(biāo)志物[4]。現(xiàn)對(duì)miRNA在蛻膜化中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類內(nèi)源性的長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過序列特異性結(jié)合發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。miRNA最經(jīng)典的調(diào)控方式是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA的5′序列被稱為“種子區(qū)域”，靶向mRNA的互補(bǔ)區(qū)域，從而介導(dǎo)mRNA的降解或翻譯抑制。因此，絕大多數(shù)已知的miRNA對(duì)相應(yīng)的靶基因發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用[5]。早期研究認(rèn)為mRNA上的靶序列僅位于3′非編碼區(qū)（3′-untranslated regions，3′-UTR），但近年的研究表明miRNA也能夠結(jié)合5′-UTR和編碼區(qū)，體現(xiàn)了其更廣泛的調(diào)節(jié)能力[6]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)大量基因包含miRNA靶點(diǎn)[7]，近年亦有研究報(bào)道m(xù)iRNA參與基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)一類核內(nèi)的miRNA能夠通過與增強(qiáng)子區(qū)結(jié)合，上調(diào)鄰近靶基因的表達(dá)水平[8]。由此可見，miRNA在細(xì)胞中的調(diào)控作用是精密且復(fù)雜的。

2 miRNA合成酶與子宮內(nèi)膜蛻膜化

miRNA的生物合成受到嚴(yán)格的時(shí)間和空間控制，它們的失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)。動(dòng)物miRNA的合成始于細(xì)胞核內(nèi)，miRNA的編碼基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄后形成miRNA初始轉(zhuǎn)錄本（primiRNA）。此時(shí)，RNA結(jié)合蛋白DGCR8和一種Ⅲ型核糖核酸酶Drosha組成微處理蛋白復(fù)合物，特異性識(shí)別pri-miRNA莖環(huán)基部并切割雙鏈，釋放一個(gè)約60～70個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中間體，即miRNA前體（premiRNA）。核內(nèi)的pre-miRNA由Exportin-5-Ran-GTP復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出核。在細(xì)胞質(zhì)中被RNA結(jié)合蛋白TRBP招募的另一種Ⅲ型核糖核酸酶Dicer切割莖環(huán)的底部，使pre-miRNA分解為成熟長(zhǎng)度的RNA雙鏈，其中包括成熟miRNA及其反向臂片段[9]。miRNA的生物合成在多個(gè)層面受到調(diào)控，包括：①miRNA轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；②Drosha和Dicer分別在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中對(duì)其進(jìn)行加工；③通過RNA編輯和RNA甲基化、尿苷化、腺苷酸化對(duì)其進(jìn)行修飾；④AGO蛋白質(zhì)的裝載；⑤RNA衰變。miRNA生物合成也可以通過非常規(guī)途徑實(shí)現(xiàn)，包括那些獨(dú)立于Drosha或Dicer的途徑，也正在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

月經(jīng)周期中，隨著蛻膜化進(jìn)展，分泌晚期的子宮內(nèi)膜基質(zhì)中Dicer蛋白水平升高[10]。Estella等[11]研究表明，用雌二醇+孕酮和環(huán)磷酸腺苷+甲羥孕酮兩種最常用的方案體外誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（human endometrial stromal cell，hESC）蛻膜化后，Dicer轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。敲低Dicer再行誘導(dǎo)蛻膜化，hESC中同源框基因A10（HOXA10）蛋白水平下降且細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白分布發(fā)生改變，提示蛻膜化受抑制。有研究表明，HOXA10影響ESC對(duì)孕酮的響應(yīng)，HOXA10缺失導(dǎo)致蛻膜化障礙和胚胎植入障礙。另有研究發(fā)現(xiàn)，Drosha蛋白在孕5～7 d的小鼠胚胎著床部位周圍的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。小鼠在體人工誘導(dǎo)蛻膜化和小鼠ESC體外誘導(dǎo)蛻膜化均能導(dǎo)致Drosha蛋白表達(dá)上調(diào)，且隨體外誘導(dǎo)蛻膜化程度的加深而逐步升高[12]。這兩種關(guān)鍵合成酶在蛻膜化過程中的改變?yōu)閙iRNA參與蛻膜化調(diào)控提供了重要依據(jù)。

3 參與子宮內(nèi)膜蛻膜化調(diào)控的miRNA

3.1 促進(jìn)蛻膜化的miRNA

3.1.1 miR-21Hu等[13]發(fā)現(xiàn)孕5～8 d小鼠子宮內(nèi)胚胎種植位點(diǎn)miR-21的表達(dá)水平上升，且著床部位miR-21表達(dá)水平高于著床位點(diǎn)間部位，其下游靶基因RECK的時(shí)間及空間分布與之相反。RECK過表達(dá)抑制了ESC中蛻膜化標(biāo)志分子基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)。MMP在子宮內(nèi)膜的蛻膜化、滋養(yǎng)層遷移、侵襲、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起著重要的作用。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)miR-21通過調(diào)節(jié)Krüppel樣因子12（Krüppellike factor 12，KLF12）和NR4A1的表達(dá)促進(jìn)體外誘導(dǎo)的hESC蛻膜化[14]。子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜miR-21表達(dá)降低，過表達(dá)miR-21可以逆轉(zhuǎn)子宮腺肌病患者離體培養(yǎng)的hESC蛻膜化不足。蛻膜中的miRNA還能以外泌體的形式進(jìn)入細(xì)胞外液，Lv等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-21在孕小鼠子宮外泌體中表達(dá)增加，且可通過上調(diào)胚胎中miR-21的水平來抑制胚胎凋亡，促進(jìn)胚胎發(fā)育，為蛻膜化與妊娠調(diào)控提供了新的視角。

3.1.2 miR-181aSu等[16]對(duì)孕豬子宮內(nèi)膜miRNA的微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-181家族中的兩個(gè)成員miR-181a和miR-181c在胚胎種植期表達(dá)升高。隨后有研究表明miR-181a在hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化后升高，并且過表達(dá)miR-181a可促進(jìn)hESC的體外蛻膜化。KLF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在胚胎植入過程中的母體子宮內(nèi)膜發(fā)育中發(fā)揮作用，其中KLF12是hESC蛻膜化的主要的負(fù)調(diào)節(jié)因素之一。miR-181a直接靶向抑制KLF12，促進(jìn)蛻膜化進(jìn)程[17]。另外，miR-181a在子癇前期患者蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞或蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)改變，可能參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展[18]。

3.2 抑制蛻膜化的miRNA

3.2.1 miR-135bmiR-135b在反復(fù)種植失敗患者的子宮內(nèi)膜中表達(dá)升高。Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)miR-135b通過靶向結(jié)合蛻膜化中重要的調(diào)節(jié)因子HOXA10抑制其表達(dá)，這一調(diào)控關(guān)系與Riyanti等[20]在不孕癥患者中的發(fā)現(xiàn)一致。而Wang等[21]則提出，miR-135b抑制了轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達(dá)，使其無法結(jié)合到PRL啟動(dòng)子區(qū)以激活PRL的轉(zhuǎn)錄。這兩種作用最終都導(dǎo)致了hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化受損，可能是miR-135b影響子宮內(nèi)膜容受性的原因。此外，Petracco等[22]還發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜間miR-135b的表達(dá)存在差異，推測(cè)其可能與子宮內(nèi)膜異位癥的病理過程有關(guān)。

3.2.2 miR-145miR-145在大鼠孕早期和在體人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中表達(dá)下調(diào)，體外誘導(dǎo)大鼠ESC蛻膜化過程中過表達(dá)miR-145可阻礙蛻膜化過程[23]。研究預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了SMAD3是miR-145的直接靶點(diǎn)，miR-145可 抑 制SMAD1及 下 游p-SMAD1/5/8、WNT4、MMP-9、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)。而且，利用過表達(dá)miR-145的ESC培養(yǎng)基培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲和遷移，這意味著miR-145可能參與蛻膜對(duì)血管生成的調(diào)控。另外，Smad1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出部分蛻膜受損，其機(jī)制可能是由蛻膜相關(guān)基因[如骨形成蛋白2（BMP2）、WNT4和COX-2]的失調(diào)引起的。血管生成是蛻膜支持滋養(yǎng)層侵襲的先決條件，血管生成不良可能導(dǎo)致種植失敗及子癇前期等不良后果。Revel等[24]對(duì)反復(fù)種植失敗患者和正常生育婦女的子宮內(nèi)膜miRNA譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)13個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中miR-145在反復(fù)種植失敗患者的表達(dá)量為正常生育婦女的3倍。另外，Bashti等[25]對(duì)55例子宮內(nèi)膜異位癥和23例正常女性血漿標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-145在Ⅰ期或Ⅱ期子宮內(nèi)膜異位癥患者中表達(dá)升高，提示miR-145或可用于子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷。

3.2.3 miR-181b與同家族成員miR-181a不同，研究發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p在hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)表達(dá)下調(diào)[11]。在hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化的過程中，miR-181b-5p通過調(diào)控金屬蛋白酶組織抑制劑3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）、ANXA2等與細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白發(fā)揮作用[26]。另一項(xiàng)研究則認(rèn)為，miR-18b1b-5p通過調(diào)控骨橋蛋白（osteopontin，OPN）參與VEGFA/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）通路抑制hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化[27]。該研究還比較了在體外受精-胚胎移植治療過程中種植成功與種植失敗患者的子宮內(nèi)膜OPN水平，發(fā)現(xiàn)種植失敗組OPN表達(dá)較低，說明這一通路可能影響了胚胎種植。

3.2.4 miR-222Qian等[28]對(duì)體外誘導(dǎo)蛻膜化與陰性對(duì)照的hESC進(jìn)行miRNA微陣列芯片分析并由熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR）驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)包括miR-222在內(nèi)的10個(gè)miRNA在蛻膜化處理組表達(dá)降低。同時(shí)，蛻膜化處理組中hESC處于S期的細(xì)胞比例減少，處于G0/G1期的細(xì)胞比例增多。靶向敲除miR-222可上調(diào)周期蛋白依賴激酶抑制因子1C（CDKN1C）的表達(dá)，從而減少hESC中S期細(xì)胞的數(shù)量。miR-222表達(dá)降低使細(xì)胞退出增殖周期而進(jìn)入分化進(jìn)程，發(fā)生蛻膜化改變。另外，一項(xiàng)隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)韓國(guó)女性中miR-222基因多態(tài)性與反復(fù)種植失敗風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[29]。

3.2.5 miR-542-3pTochigi等[30]利用miRNA微陣列芯片分析鑒定得出，hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化組與陰性對(duì)照組有6個(gè)差異表達(dá)的miRNA，蛻膜化組中miR-542-3p表達(dá)水平較陰性對(duì)照組下調(diào)70%。miR-542-3p直接靶向抑制IGFBP1，從而抑制hESC的形態(tài)改變和蛻膜化關(guān)鍵基因PRL、WNT4的表達(dá)。該課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白N5（high-mobility group N5，HMGN5）是miR-542-3p的上游調(diào)控蛋白，這種核蛋白通過與染色質(zhì)纖維中的核小體核心顆粒特異性結(jié)合改變?nèi)旧w致密程度，HMGN5表達(dá)下降導(dǎo)致染色體纖維致密化，抑制miR-542-3p的生成[31]。Qu等[32]研究則認(rèn)為miR-532-3p通過靶向抑制整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）信號(hào)通路中的重要分子TGF-β1和SMAD2表達(dá)下調(diào)，從而影響蛻膜化。在hESC中過表達(dá)miR-542-3p可抑制VEGF、COX-2和MMP-9的表達(dá)，其培養(yǎng)基上清液具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成作用，提示miR-542-3p可能參與子宮內(nèi)膜容受性損傷、子癇前期等病理、生理過程。

3.2.6 其他抑制蛻膜化的miRNAYang等[33]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-290-5p可降低N-myc下游調(diào)節(jié)基因3（N-myc downstream-regulated gene 3，NDRG3）的表達(dá)，抑制小鼠ESC體外蛻膜化，這與NDRG3激活RAF-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化有關(guān)。Pei等[34]研究表明，miR-194-3p通過對(duì)孕酮受體（progesterone receptor，PGR）的負(fù)調(diào)控抑制hESC體外誘導(dǎo)的蛻膜化，而輕度子宮內(nèi)膜異位癥患者分泌中期在位子宮內(nèi)膜中miR-194-3p表達(dá)增加，PGR表達(dá)減少。Zhou等[35]發(fā)現(xiàn)miR-196a抑制hESC蛻膜化，且在輕度子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜中表達(dá)顯著增加。雖然該研究并未找到miR-196a的直接靶基因，但發(fā)現(xiàn)miR-196a表達(dá)的升高導(dǎo)致磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK）/p-ERK蛋白表達(dá)上調(diào)和PGR-A、PGR-B蛋白表達(dá)下調(diào)。Pei等[34]和Zhou等[35]認(rèn)為miR-194-3p、miR-196a和各自下游通路可影響子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜的孕激素抵抗。在小鼠延遲種植受體模型中發(fā)現(xiàn)，miR-101a和miR-199a*表達(dá)在時(shí)間及空間上的分布與COX-2有關(guān)，并發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，miR-101a在蛻膜化過程中的表達(dá)與COX-2蛋白水平呈負(fù)相關(guān)[36]。而COX-2被廣泛證實(shí)在妊娠早期蛻膜化和著床中起到促進(jìn)作用[37]。miR-96通過調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制小鼠ESC體外誘導(dǎo)的蛻膜化水平，這與miR-96靶向下調(diào)抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）有關(guān)[38]。miR-148a-3p在反復(fù)種植失敗患者內(nèi)膜中表達(dá)升高，且過表達(dá)miR-148a-3p或抑制其靶基因HOXC8的表達(dá)均能使hESC體外誘導(dǎo)蛻膜化受損[39]。此外，miR-149通過與多腺苷二磷酸核糖聚合酶2[poly（ADP-ribose）polymerase-2，PARP-2]作用抑制hESC的蛻膜化，參與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控[40]。

4 結(jié)語與展望

一些miRNA參與了子宮內(nèi)膜蛻膜化的雙向調(diào)控，其具體作用機(jī)制包括調(diào)控激素受體、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞自噬和細(xì)胞周期等。同時(shí)，尚有許多測(cè)序篩選的差異miRNA的作用有待進(jìn)一步研究。子宮內(nèi)膜蛻膜化是人類子宮內(nèi)膜周期性變化以及妊娠建立和維持至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對(duì)于miRNA的研究有助于完善子宮內(nèi)膜蛻膜化分子調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，并為蛻膜化受損相關(guān)女性生殖系統(tǒng)疾病的診治提供參考。