全球基因I 型非洲豬瘟病毒流行與疫苗研究進展

戈勝強，屈海龍，路皓東，韓乃君，胡永新，左媛媛，張瀟月，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學，山東泰安 271001）

非洲豬瘟病毒于1921 年在肯尼亞（非洲東部）首次報道，但該文章提到早在1909 年時就發(fā)現(xiàn)有類似疫病流行，且主要在肯尼亞的歐洲殖民者引入的家豬群體中暴發(fā)[1-2]。所以非洲豬瘟最早還被稱為“東部非洲豬瘟（east African swine fever）”?？紤]到非洲野豬（疣豬、叢林豬等）感染后不發(fā)病且非洲存在森林循環(huán)（野豬與軟蜱相互感染傳播），所以推斷非洲豬瘟病毒可能早已在非洲大陸出現(xiàn)[3]。后期追溯調(diào)查顯示，1921 年，在贊比亞東部省份（非洲中南部）也發(fā)現(xiàn)有類似疫病發(fā)生[4]。隨后，非洲Maasstroom 地區(qū)（南非東北部，1928年）[5]，安哥拉共和國（非洲西南部，1932 年）和馬拉維共和國（非洲東南部，1931 年）均報道發(fā)現(xiàn)該病。至1950 年，非洲東部、南部和中非南部均已發(fā)現(xiàn)該病。但直至20 世紀50 年代后期傳入西非以及歐洲葡萄牙（1957 年）、西班牙（1960 年）等國家后非洲豬瘟才開始被全世界關注和研究[6]。1957 年后在歐洲、南美洲和加勒比地區(qū)流行的毒株均為基因I 型毒株（基于P72基因C 末端序列分型），因此基因I 型毒株也曾被稱為ESAC-WA基因型，即歐洲、南美洲、加勒比海地區(qū)和西非流行 株（Europe，South America，the Caribbean and West Africa，ESAC-WA）[7]。伴隨著葡萄牙、西班牙經(jīng)過30 多年的根除凈化成功，2000 年之前除意大利撒丁島（基因I 型）和非洲存在非洲豬瘟（24個基因型皆有）外，其他國家均全部消滅非洲豬瘟。但2007 年基因II 型非洲豬瘟傳入格魯吉亞后，全世界再次陷入基因II 型的流行擴散中，歐亞大陸北部（俄羅斯，2007 年）、東歐（烏克蘭，2012 年）、中歐（波蘭，2014 年）、西歐（比利時，2018 年）、東亞（中國，2018 年）、東南亞（越南，2019 年）、南亞（印度，2020 年）、大洋洲（巴布亞新幾內(nèi)亞，2020 年）和加勒比地區(qū)（多米尼加，2021 年）均相繼暴發(fā)非洲豬瘟。2021 年中國報道在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)基因I 型非洲豬瘟病毒，與當前流行的基因II 型強毒株差異顯著?；騃 型毒株在亞洲區(qū)域?qū)儆谑状伟l(fā)現(xiàn)，國內(nèi)目前尚無專業(yè)介紹，沒有全面展示基因I 型非洲豬瘟病毒的流行與研究現(xiàn)狀，為此作者就此方向進行綜述，以期為我國非洲豬瘟的科學防控提供參考。

1 全球流行概述

自非洲豬瘟首次被報道以來（1921 年），早期發(fā)現(xiàn)的毒株因技術/年代久遠等原因未進行基因分型。目前可追溯的最早明確的基因I 型毒株可能是1957 年首次傳入葡萄牙的里斯本57 毒株（Lisbon 57，Genbank-AF301537），后經(jīng)序列比對，認為該毒株最可能來源于剛果民主共和國[3]。隨后，第二次傳入葡萄牙并在歐洲蔓延的里斯本60 毒株（Lisbon 60，AF301539）、1962年西班牙毒株（Madrid/62，AF449461）、1964 年法國毒株（Fr64，F(xiàn)J174374）、1968 年葡萄牙自然弱毒株（NH/P68，DQ028313）、1985 年比利時毒株（BEL/85，AF449466），1988 年葡萄牙軟蜱分離弱毒株（OUR T88/3，AM712240），以及在南美洲發(fā)現(xiàn)的1979 年巴西毒株（Brazil/79，AF302809）和在加勒比海地區(qū)發(fā)現(xiàn)的1979 年多米尼加共和國毒株（DomRep/79，AF301810）等也均屬于基因I 型[7]。上述國家/地區(qū)（除非洲和意大利撒丁島），通過多種根除策略，均成功根除該病。即截至2000 年，基因I 型毒株理論上只存在于意大利撒丁島、非洲地區(qū)和歐洲部分實驗室（用于致病性和疫苗研究）。

非洲豬瘟病毒的24 個基因型在非洲均有分布，其中基因I 型主要分布在西非。據(jù)報道[8]，1959 年塞內(nèi)加爾共和國（西非西部）有非洲豬瘟疫情確診。1973 年，尼日利亞聯(lián)邦共和國（西非東南部）發(fā)現(xiàn)過非洲豬瘟疑似病例（未官方確認），但直到1997 年官方才正式確認本地存在非洲豬瘟[9]。1982 年，喀麥隆共和國（非洲中西部）報道有基因I 型毒株流行[10]。但西非的基因I 型毒株流行蔓延主要開始于1996 年，由科特迪瓦共和國開始逐步擴散傳播至貝寧共和國、佛得角共和國（1996—1999 年）、多哥共和國、尼日利亞聯(lián)邦共和國（1997年）、塞內(nèi)加爾共和國（1996—1999 年、2001 年和2002 年）、加納共和國（1999 年）、岡比亞共和國（1997 年和2000 年）、布基納法索（2003 年），直至傳入馬里共和國（2016 年）[7，11-13]。此外，基因I型毒株在剛果民主共和國（非洲中部，1967年）、安哥拉共和國（非洲西南部，1972 年）、姆庫茲（南非，1979 年）、納米比亞共和國（非洲西南部，1980 年）、贊比亞（非洲中南部，1983 年）[14]和津巴布韋共和國（非洲東南部，1990 年）等國家也有被分離的報道[7，15]。進一步分析顯示，同屬于基因I 型的毒株可以進一步被P54基因分為a、b、c、d 四個分支。占比最大的Ia 分支毒株主要來源于歐洲和南美洲地區(qū)，Ib分支毒株主要來自西非國家（還包括最早傳入歐洲的Lisbon 57）。而1960 年傳入葡萄牙的Lisbon 60 被劃為Ic 分支，1979 年南非毒株（MZUKI/1979）被劃為Id 分支[15]。結(jié)合血清群分型差異（Lisbon 57 毒株和Lisbon 60 毒株分別屬于血清1 群和血清4 群）[16]，可以推斷分別于1957 年和1960 年傳入葡萄牙的基因I 型毒株可能為不同來源毒株。

2 弱毒活疫苗研發(fā)進程

基因I 型非洲豬瘟傳入歐洲后，給當?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成巨大影響。如1960 年4 月非洲豬瘟傳入葡萄牙后，截止到12 月已擴散至16 個省份的187 個地點，造成14 629 頭豬死亡或被撲殺，并于同年傳入西班牙[17]。為快速、有效控制該病，葡萄牙和西班牙均啟動了弱毒活疫苗（細胞傳代致弱株）的臨床試驗。葡萄牙臨床試驗規(guī)模達55 萬多頭，而西班牙試驗規(guī)模較?。ń涣魉茫?。但因種種原因，特別是弱毒活疫苗使用后的并發(fā)癥問題超過了試驗預期，最終導致試驗終止。大規(guī)模臨床試驗不可避免導致毒株外溢，并被學術界認為與伊比利亞半島隨后30～40 年間的低毒力毒株流行相關聯(lián)[18]。特別是1968 年葡萄牙從一慢性感染豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的無紅細胞吸附活性的自然弱毒株NH/P68 毒株（也稱NHV），經(jīng)推測可能就是葡萄牙臨床使用的弱毒疫苗候選株演變而來[19]。1988 年，葡萄牙又從棲居于豬場的游走鈍緣蜱（O.erraticus）中分離到無紅細胞吸附活性的弱毒株，命名為OUR T88/3、OUR T88/4 和OUR T88/5 等[20]。自然弱毒株NH/P68 和OUR T88/3 的發(fā)現(xiàn)為基因I 型非洲豬瘟病毒疫苗研制提供了新方向。

2.1 自然弱毒株

2001 年，Leit?o 等[21]將31 頭25～45 kg 的 長白雜交豬以5×106CPE50/頭的劑量接種NH/P68，結(jié)果肌肉注射和口鼻接種的豬中分別有47%（9/19）和25%（3/12）出現(xiàn)慢性病程（主要癥狀包括體溫升高、皮膚壞死斑和關節(jié)腫大）。隨后對無癥狀的豬以5×106CPE50/頭的劑量肌肉注射接種基因I 型強毒株Lisbon 60，結(jié)果所有豬均能抵御強毒株攻擊，但79%（15/19）的豬有一過性體溫升高（2～5 d）。另有試驗[22]證實，4 頭雜交豬以105TCID50/頭的劑量肌肉注射接種NH/P68 后，于第72 天再放入2 頭未接種哨兵豬，結(jié)果4 頭接種豬出現(xiàn)不同程度的慢性病程（癥狀包括體溫升高、關節(jié)腫大、體重減輕和伴隨陣發(fā)性咳嗽的呼吸困難），而2 頭哨兵豬中1 頭出現(xiàn)慢性病程（癥狀包括體溫升高、關節(jié)腫脹和呼吸系統(tǒng)問題），1 頭除有輕微體溫升高外未有明顯臨床反應，但2 頭豬均抗體轉(zhuǎn)陽。相似的，OUR T88/3 的接種試驗[23]發(fā)現(xiàn)：以103～105TCID50/頭的劑量鼻內(nèi)或肌肉注射接種OUR T88/3 后（每組6 頭）于第21 天再肌肉注射強毒株OUR T88/1（104TCID50/頭），結(jié)果103～105TCID50的鼻內(nèi)接種組攻毒后保護率分別為100%、100%和66%（4/6），103～104TCID50的肌肉注射接種組攻毒后保護率分別為50%（3/6）和67%（4/6），且各組存活豬中部分出現(xiàn)體溫升高、關節(jié)腫脹、皮膚壞死斑、結(jié)膜炎等慢性非洲豬瘟病癥。此外，105TCID50肌肉注射組中有3 頭豬因出現(xiàn)非特異性體溫升高而終止試驗（經(jīng)排查可能之前有細菌感染）。以上試驗說明，自然弱毒株NH/P68 和OUR T88/3 仍具有一定毒力，并不太適合作為疫苗種毒。

2.2 基因缺失株

雖然基因I 型自然弱毒株無法滿足疫苗使用條件，但基于此毒株的疫苗研究方向并沒有停止。利用基因敲除重組技術，研究者以NH/P68 或OUR T88/3 為骨架，繼續(xù)敲除毒力基因或免疫調(diào)控基因，分別獲得NH/P68ΔA238L、NH/P68ΔA224L、NH/P68ΔEP153R[24]和OUR T88/3ΔDP2[25]等多種基因缺失株。結(jié)果顯示以NH/P68 為骨架的基因缺失株接種（106TCID50/頭，肌肉注射）后出現(xiàn)臨床副反應的比例分別是100%（ΔA238L）和75%（ΔA224L和ΔEP153R），但攻毒（Lisbon 60，105TCID50/頭）后能提供完全保護。以OUR T88/3 為骨架的缺失株接種（104TCID50/頭，肌肉注射）后有50%（3/6）的豬出現(xiàn)臨床副反應（體溫升高和關節(jié)腫脹），攻毒（OUR T88/1，104HAD/頭）后保護率為67%（4/6）。同時，基于基因I 型強毒株的基因缺失改造工作也在不斷嘗試。2017 年，Monteagudo等[26]以BA71 強毒株（1971 年分離自西班牙巴達霍斯省一發(fā)病豬脾臟）為骨架敲除CD2v基因（BA71ΔCD2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BA71ΔCD2接種家豬（103PFU/頭，肌肉注射）后無任何臨床癥狀，攻毒（BA71，103HAU/頭）后保護率為33%（2/6），但大劑量（3.3×104PFU/頭或106PFU/頭）免疫BA71ΔCD2后能提供完全攻毒保護。為進一步解決BA71ΔCD2免疫后個別豬只中存在低載量病毒血癥問題，研究者在BA71ΔCD2基礎之上繼續(xù)刪除了DP96R基因（BA71ΔCD2DP96R）和EP153R基因（BA71ΔCD2EP153R），結(jié)果發(fā)現(xiàn)BA71ΔCD2DP96R和BA71ΔCD2EP153R接種（106PFU/頭，肌肉注射）后仍存在低載量病毒血癥，而且攻毒后（Georgia 2007/1，103HAU/頭）保護率分別降為83%（5/6）和67%（4/6）。這說明敲除DP96R和EP153R基因后并沒有增加BA71ΔCD2的安全性，反而使其攻毒保護能力降低[27]。此外，研究者還以Benin 97/1 強毒株（1971 年分離自西非貝寧共和國發(fā)病豬場）為骨架敲除了MGF基因（BeninΔMGF）。結(jié)果顯示：BeninΔMGF接種2 次（肌肉注射，首免102TCID50/頭，25 d 后第二次免疫，104TCID50/頭）后出現(xiàn)一過性體溫升高，無任何臨床癥狀。一次免疫后第46 天，使用強毒株Benin 97/1 進行攻毒（104TCID50/頭，肌肉注射），體溫、臨床表現(xiàn)均正常[28]。相似的，以Benin 97/1 強毒株為骨架敲除了DP148R基因（BeninΔDP148R），接種2 次（肌肉注射，首免103HAD50/頭，21 d 后重復加免1 次）后出現(xiàn)一過性體溫升高（持續(xù)1～2 d），無任何臨床癥狀。一次免疫后第42 天，使用強毒株Benin 97/1 進行攻毒（104HAD50/頭，肌肉注射），結(jié)果2 頭豬出現(xiàn)體溫升高，其余3 頭豬體溫、臨床表現(xiàn)正常[29]。分析以上所有基因缺失毒株結(jié)果，可以推斷基因敲除策略可以提高毒株的安全性和保護效果，但具體基因的使用搭配等需要進行大量試驗驗證，目前還未有理想的基因I 型基因缺失疫苗候選株進一步進行臨床試驗。

2.3 細胞傳代致弱株

葡萄牙弱毒活疫苗（以1960 年分離的Lisbon 60 毒株或1961 年分離的1455 毒株為母本毒株，在豬骨髓細胞上連續(xù)傳代所得）[17]臨床試驗終止后，雖然再沒有進行過大規(guī)模的相關試驗，但可以明確的是，非洲豬瘟病毒經(jīng)過細胞連續(xù)傳代可以導致毒力減弱。以此為理論依據(jù)，研究者對非洲豬瘟強毒株進行了多種細胞系的傳代適應改造，研制了多種細胞傳代致弱株并進行了動物試驗評價[30]。但因基因分型技術早期還無法應用，所以細胞傳代致弱株的研究一開始并沒有特別關注基因I 型，而是對現(xiàn)有分離株進行了多種嘗試。如Hinde 毒株（分離自肯尼亞，可能為基因X 型）和Tengani 毒株（分離自馬拉維，可能為基因V 型）[7]分別在豬腎細胞（1968 年）[31]和幼倉鼠腎細胞（1974 年）[32]中連續(xù)傳代致弱?；騃 型的傳代致弱株研究主要是以西班牙或葡萄牙本地分離株為主，如經(jīng)典毒株BA71v（將1971 年西班牙分離株BA71 在Vero 傳代致弱）[33]和E75CV1（將1975 年西班牙分離株在猴腎成纖維細胞傳代致弱）[34]。進一步研究[35]顯示，家豬接種E75CV1（104HAU50/頭，肌肉注射）能全部存活且能抵御同源強毒株（E75，104HAU50/頭）的攻擊，但105HAU50/頭和102HAU50/頭接種組的存活率均為50%（2/4）。近期文章[36]顯示，俄羅斯聯(lián)邦病毒學和微生物學研究中心（原全俄獸醫(yī)病毒學與微生物學研究所）對細胞傳代致弱株也進行了大量研究，特別是對基因I 型細胞傳代弱毒株FK-32/13（將法國1964 年分離株France-32，在豬骨髓細胞傳代135 代致弱）進行了深入研究。試驗數(shù)據(jù)顯示：家豬接種FK-32/135（107.3HAU50/頭口服接種，或106.7HAU50/頭肌肉注射）后臨床反應程度在正常范圍內(nèi)且能抵御同血清群強毒株的攻擊（保護率為80%～100%）；進一步濃縮，使用25 倍濃縮劑量（108.3HAU50/頭，肌肉注射）接種后可在7 d 時產(chǎn)生80%～100%的攻毒保護效果，免疫保護期達4 個月且不干擾其他病毒疫苗效果；使用100 倍濃縮劑量（109.2HAU50/頭，肌肉注射）接種后最快可在第3 天對強毒株（France-32，104.0HAU50/頭）產(chǎn)生100%的免疫保護。分析以上所有細胞傳代致弱株結(jié)果，可以推斷細胞連續(xù)傳代可以達到致弱非洲豬瘟病毒的目的。但要對其進行科學評價特別是合適傳代次數(shù)的篩選，需要開展大量試驗驗證，工作量巨大且具有一定的盲目性和隨機性。

3 流行演變推測及防控策略

根據(jù)國外基因I 型自然弱毒株（NH/P68 和OUR T88/3）研究數(shù)據(jù)和國內(nèi)基因I 型分離株（HeN/ZZ-P1/21 和SD/DY-I/21）試驗數(shù)據(jù)[37]，可以判斷國內(nèi)分離的基因I 型毒株仍具有一定毒力，仍會導致一定的臨床表現(xiàn)，特別是關節(jié)腫脹、皮膚壞死等非洲豬瘟慢性病程典型癥狀，而且具有一定的水平傳播能力。基因I 型毒株與基因II 型毒株（強毒株、變異株）共同在國內(nèi)存在，提示當前防控形勢更加復雜，特別是冬季來臨后，低溫環(huán)境對消毒劑會產(chǎn)生一定的影響且正好滿足非洲豬瘟病毒低溫環(huán)境抵抗力強的特點。因此，假如陽性病例出現(xiàn)后凈化不徹底，病毒可能會進一步污染屠宰場、市場，乃至人員日常接觸頻繁的紙幣、日常用品等，并導致環(huán)境病毒載量居高不下，給豬場造成巨大的傳入風險。在此情況下，深入了解環(huán)境病毒污染面，及時進行消毒滅源工作極其重要。

基因I 型病毒與基因II 型病毒基因組序列存在一定差異，特別是CD2v和MGF（多基因家族）部分區(qū)域差異較大?，F(xiàn)有的常用熒光定量診斷方法（以P72基因為靶基因）或三重熒光定量方法（以P72、CD2v和MGF基因為靶基因）需要進行更深入的評價，確定其對基因I 型毒株的敏感性或特異性是否發(fā)生變化。此外，對于毒力較弱的基因I 型毒株或基因II 型變異株，血清學診斷方法具有一定的差異優(yōu)勢，因此也需加快其產(chǎn)業(yè)化報批進程并適時推廣應用。同時，非洲豬瘟病毒已在我國定殖并形成較大污染面，進行疫病間交叉感染影響及多種疫病的多重診斷方法研究也具有一定實際意義。非洲豬瘟在長時間流行傳播過程中存在毒力減弱趨勢，結(jié)合臨床中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因I 型毒株和基因II 型變異株，未來臨床中出現(xiàn)癥狀溫和，乃至無任何臨床癥狀的非洲豬瘟病例可能增加，這會導致出現(xiàn)“耐過豬”/“存活豬”現(xiàn)象并難以早期發(fā)現(xiàn)，值得警惕和重視。