不同品溫大曲及其曲房空氣的細(xì)菌群落變化規(guī)律和相關(guān)性

姚亞林，鄧杰，任志強(qiáng)，衛(wèi)春會，鐘姝霞，黃治國

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

（2.四川健能制藥有限公司，四川自貢 643000）

“曲乃酒之骨”，大曲是大曲白酒生產(chǎn)必不可少的糖化發(fā)酵劑。大曲是在自然條件下制成的集微生物菌系、酶系及物系于一體的復(fù)合生物制品，其微生物群落是影響大曲品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[1,2]。大曲微生物類群極為豐富，主要包括霉菌、細(xì)菌、酵母菌等，其中細(xì)菌是發(fā)酵生香的主要動力。大曲生產(chǎn)是采用自然接種發(fā)酵的，其發(fā)酵微生物主要來源于自然環(huán)境，而環(huán)境的變化使得微生物群落變化，從而使大曲的質(zhì)量有所不同[3]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)越來越多地運(yùn)用在解析特定的微生物群落結(jié)構(gòu)等微生物研究中[4,5]。吳樹坤[6]利用高通量測序比較分析四川不同地區(qū)濃香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)大曲的微生物多樣性存在差異；羅惠波[7]通過PCR-SSCP分析了濃香型大曲發(fā)酵過程中真核微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)其真核微生物群落的生物多樣性在大曲發(fā)酵過程中呈先升后降再升高并保持穩(wěn)定的變化趨勢。目前對于大曲的研究多集中在制作工藝、微生物群落結(jié)構(gòu)及儲藏中的菌系與酶系等變化上[8-11]，而對于制曲微生態(tài)環(huán)境對大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及相關(guān)性的研究較少。唐玉明[12]應(yīng)用多元方差分析法探索了制曲車間不同環(huán)境場地間空氣微生物種群和數(shù)量差異，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境的微生物差異顯著，并且在大曲不同的發(fā)酵階段，微生物的含量和種類均有所不同。Li[13]研究不同工藝的中、低溫大曲的微生物群落變化發(fā)現(xiàn)，在不同環(huán)境作用下，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?？諝馕⑸镌诎拙漆勗煺麄€環(huán)節(jié)，無論是制曲還是發(fā)酵，都起到自然接種的作用[14,15]，而微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究和分析是揭示釀造過程的代謝規(guī)律和生態(tài)響應(yīng)的重要手段。

本研究以高通量測序技術(shù)為手段，以瀘州地區(qū)的中溫大曲和高溫大曲及其曲房空氣為研究對象，探究大曲與曲房空氣的細(xì)菌群落相關(guān)性以及演替規(guī)律，并結(jié)合環(huán)境因素，初步驗(yàn)證環(huán)境因素與大曲微生物群落的相關(guān)性，為今后大曲生產(chǎn)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：采自川南地區(qū)的某濃香型酒廠和某醬香型酒廠不同發(fā)酵階段的大曲及其對應(yīng)曲房空氣為樣品，濃香型大曲發(fā)酵周期為30 d，高溫大曲的發(fā)酵周期為45 d。同一生產(chǎn)階段大曲及對應(yīng)曲房空氣采取三個平行樣本，利用Corolis μ 空氣生物采樣器采集曲房空氣，再將其轉(zhuǎn)入裝有無菌水的玻璃瓶中；無菌采集大曲后裝入無菌的自封袋中，置于冰盒中迅速運(yùn)回，粉碎后混勻，保存于-20 ℃留待高通量測序。取樣環(huán)境參數(shù)如表1、表2 所示。

表1 濃香型大曲及空氣樣品參數(shù)Table 1 Sample lable of medium-temperature Daqu and workshop air

表2 高溫大曲及空氣樣品參數(shù)Table 2 Sample lable of high-temperature Daqu and workshop air

DNA 提取純化試劑：PowerSoil DNA Isolation Ki（tMOBIO，美國）；Gel Extraction Kit（康為世紀(jì)，中國）；Quant-iTPicoGreen DNA Kit（Invitrogen，美國）；十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉（Sigma-aldrich，美國）。

PCR 試劑：buffer、MgCl2、EX taq 酶、dNTPs、DNA Marker（Takara，日本）；正反向引物（成都擎科，中國）；高通量測序試劑由美國Roche 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

空氣生物采樣器（Corolis，法國）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo，美國）；高速離心機(jī)（Eppendorf，德國）；均質(zhì)機(jī)（SCILOGEX，美國）；熒光分光光度計(jì)（Promaga，美國）；高通量測序儀（Roche，美國）；低溫冰箱（Thermo，美國）；水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR 儀（Bio-rad，美國）。

1.3 方法

1.3.1 空氣樣品的總DNA 提取

空氣樣品前處理：在無菌條件下取200 mL 水樣，先后用定性濾紙（8 μm，47 mm）和硝化纖維濾膜（0.22 μm，47 mm）進(jìn)行抽濾，收集水樣中的微生物，將濾膜置于50 mL 離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

空氣樣品DNA 提?。翰捎胊nalytikjena 公司innu SPEED Soil DNA Kit 試劑盒提取空氣中細(xì)菌的總DNA，提取后DNA 樣品取5 μL DNA 樣品于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。DNA 樣品于-20 ℃保存。

1.3.2 大曲樣品的總DNA 提取

準(zhǔn)稱5 g（干重計(jì)）曲粉，采用改良后的CTAB[16]法提取大曲樣品中的細(xì)菌總DNA。將提取的大曲和空氣DNA 樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 大曲理化指標(biāo)的測定

大曲淀粉、水分和酸度的測定參考《釀酒分析與檢測》[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序數(shù)據(jù)通過Mothur 軟件處理分析，理化檢測結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。主成分分析采用SPSS 25.0 軟件分析作圖，并使用Canoco 5.0 軟件對測序數(shù)據(jù)與理化結(jié)果做冗余分析。

2 結(jié)果分析

2.1 測序有效性分析

稀釋曲線是用來評價測序量是否足以包含所有類群，并能夠間接性反應(yīng)樣品的物種豐富度。根據(jù)圖1的結(jié)果可以看出，隨測序深度的增加各樣品的稀釋性曲線變化趨勢呈現(xiàn)先增加后趨于平緩，這表明測序的數(shù)據(jù)量較為合理，測序的深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。

圖1 大曲及其空氣樣品稀釋曲線Fig.1 The rarefaction curve of sample in Daqu and workshop air

圖2 中溫大曲和空氣細(xì)菌屬群落分布Fig.2 The bacterial community structure in medium-temperature Daqu and workshop air

圖3 高溫大曲和空氣細(xì)菌屬群落分布Fig.3 The bacterial community structure in high-temperature Daqu and workshop air

2.2 大曲和曲房空氣中細(xì)菌群落多樣性分析

將高通量測序所得序列與silva 細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個OTU 在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)，兩個酒廠大曲和曲房空氣的細(xì)菌屬組成如圖所示。在屬分類學(xué)水平上，將沒有明確的分類信息歸為一類，即unclassified。

如圖2 所示，從中溫大曲和其曲房空氣中共得到33 個細(xì)菌屬的結(jié)構(gòu)信息。隨著發(fā)酵溫度的增加，大曲與曲房空氣細(xì)菌種類均呈減少趨勢；發(fā)酵溫度下降后，大曲與曲房空氣細(xì)菌種類明顯增加；到了貯存期后，曲房空氣的種類逐漸減少，而大曲細(xì)菌種類較為明顯地增加，并且大曲細(xì)菌種類高于空氣中的細(xì)菌種類。其中，芽孢桿菌屬（Bacillus）在大曲和空氣的各個階段都占有較大比例，并隨著發(fā)酵進(jìn)行在大曲中不斷積累。芽孢桿菌屬是一類抗逆特性較強(qiáng)的菌群，是白酒釀造中豐富酶系和白酒風(fēng)味成分的重要功能菌[18]。此外，從圖中還可以看出，乳桿菌屬（Lactobacillus，1.74%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，1.92%）、泛 菌 屬（Pantoea， 11.02% ） 和 金 黃 桿 菌 屬（Chryseobacterium，1.37%）這幾類菌屬在開始發(fā)酵階段只存在于空氣中，在隨后發(fā)酵的低溫期逐漸進(jìn)入大曲中得到積累，而魏斯氏屬（Weissella，7.34%）、Gurvibacter（1.06%）和根瘤菌屬（Rhizobium，1.12%）在開始發(fā)酵階段只存在于大曲中，在低溫期和高溫期階段進(jìn)入空氣并逐漸穩(wěn)定。即在大曲發(fā)酵及儲存過程中，由于大曲中營養(yǎng)豐富，且大曲與空氣中的微生物處于動態(tài)遷移的狀態(tài)，曲中的多種重要釀造微生物都是從空氣中網(wǎng)羅而得，而隨時間變化部分微生物種類不適應(yīng)大曲環(huán)境而轉(zhuǎn)移至空氣中，使得大曲與空氣中的細(xì)菌種類處于此消彼長的狀態(tài)。這與車路萍[19]的研究結(jié)果較為符合。

如圖3，從高溫大曲和其曲房空氣中得到31 個屬結(jié)構(gòu)信息。隨著大曲的發(fā)酵，除大曲入房4 d 時的大曲細(xì)菌種類增加以外，大曲和曲房空氣中細(xì)菌的種類均逐漸減少，且在整個過程中，大曲中細(xì)菌種類多于曲房空氣中的細(xì)菌種類。隨著大曲發(fā)酵進(jìn)行，溫度升高，大曲的營養(yǎng)物質(zhì)、水分等不斷變化，大曲及空氣中不能適應(yīng)高溫的細(xì)菌逐漸消亡，而能夠適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌種類在大曲中不斷富集，同時部分微生物在大曲與空氣之間存在動態(tài)的物質(zhì)能量交換，使得大曲與曲房空氣的細(xì)菌群落組成處于動態(tài)變化。慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus，9.32%）和乳桿菌（10.22%）屬在發(fā)酵0 d 時只存在于空氣中，在發(fā)酵4 d 時進(jìn)入大曲中生長積累；假單胞菌屬(Pseudomonas)在發(fā)酵0 d 時大曲和曲房空氣中都存在，隨發(fā)酵變化，逐漸在空氣中累積達(dá)到較高豐度（17.14%）；高溫放線菌屬是傳統(tǒng)高溫大曲中的優(yōu)勢菌屬，對生長溫度具有極高的耐受性，發(fā)酵全過程都存在大曲中，并在發(fā)酵、貯存中不斷生長累積。

通過比較兩種大曲制曲過程中的細(xì)菌群落的分布及變化發(fā)現(xiàn)，高溫大曲及其空氣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與中溫大曲及空氣有所差異，主要是由于所用母曲、制曲工藝、制曲環(huán)境等不同引起的。芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬[4]在中、高溫大曲發(fā)酵的整個階段都占較大比重，在兩種大曲中都屬于優(yōu)勢菌群，最終在儲存期的豐度分別占到了 23.12%和 9.47%、27.04%和23.18%。這兩類菌屬都是對豐富白酒釀造的酶系和物系起著重要作用，是大曲微生物菌系中不可或缺的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)高溫放線菌屬其不僅存在于高溫大曲中，在濃香型大曲中也有較高的分布，其豐度主要受制曲溫度的影響[20-22]。劉延波對濃香型中溫曲和高溫曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，其高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬的的豐度從中溫（5.43%和2.56%）到高溫（12.29%和20.93%）都顯著上升，與本研究結(jié)果基本一致。在中溫大曲中，隨發(fā)酵進(jìn)行，高溫放線菌屬由空氣進(jìn)入大曲中累積，在大曲中呈先升高后降低的變化趨勢；而在高溫大曲中隨發(fā)酵進(jìn)行呈升高趨勢，在發(fā)酵前期空氣中僅短暫存在后消亡，這可能是受空氣營養(yǎng)缺乏的影響。此外，其他微生物類群也存在動態(tài)遷移，如乳桿菌屬、泛菌屬等釀造功能微生物都是從空氣進(jìn)入中溫大曲中生長累積，并影響其群落結(jié)構(gòu)。在兩種大曲發(fā)酵過程中，都存在著空氣微生物與大曲微生物的短暫交替循環(huán)，主要是受到環(huán)境影響，微生物自主地選擇適合生存的空間[23]。

2.3 大曲及曲房空氣細(xì)菌群落相關(guān)性分析

圖4 中溫大曲與曲房空氣樣品的細(xì)菌主成分分布Fig.4 Principal component analysis of the bacterial community structure in medium-temperature Daqu and workshop air

為探究大曲與曲房空氣細(xì)菌群落的相關(guān)性，對兩個酒廠不同階段大曲與曲房空氣樣品的OTUs 各自通過SPSS 進(jìn)行主成分分析，根據(jù)樣品在主成分各個維度上的位置，分別以PC1 和PC2 為橫、縱坐標(biāo)軸作圖，得到樣品在主成分上的散點(diǎn)圖，根據(jù)樣品間在分布圖中的距離判斷其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性和相似性。結(jié)果表明，圖4中的第一軸能夠解釋數(shù)據(jù)56.58%的變量、第二軸能夠解釋數(shù)據(jù)30.37%的變量。瀘州地區(qū)中溫大曲及其曲房空氣細(xì)菌群落在發(fā)酵初期較為相似，表明大曲前期可能是微生物自然接種培菌的重要時期之一，這與羅惠波[24]、車路萍[25]的研究結(jié)果基本一致。并且L1-K、L2-K、L3-K、L4-K、L5-K 在PC1 上距離接近，表明空氣細(xì)菌群落組成在發(fā)酵整個時期都較為相似。而大曲發(fā)酵的高溫階段到儲存階段的細(xì)菌群落組成與空氣相差較大，與發(fā)酵的升溫以及后期儲存的低水分可能有較大的關(guān)聯(lián)。

高溫大曲及曲房空氣的細(xì)菌群落組成在PC1、PC2 上的分布如圖5 所示，G2-K、G3-K、G5-K 和G1-D、G2-D、G4-D、G5-D 在PC1 上較為集中，表明這幾個階段的大曲及空氣細(xì)菌群落組成相似，微生物存在相互影響。而G3-D 相距其他樣點(diǎn)較遠(yuǎn)，可能受高溫大曲的高溫階段影響較大。

圖5 高溫大曲與曲房空氣樣品的細(xì)菌主成分分布Fig.5 Principal component analysis of the bacterial community structure in high-temperature Daqu and workshop air

制曲過程中，不同環(huán)境的微生物都存在差別，對曲藥的微生物結(jié)構(gòu)及感官質(zhì)量有著重要影響[10,24]，車路萍對中、高溫大曲及空氣微生物種類和生物量研究發(fā)現(xiàn)，不同溫度大曲及其曲房空氣均含其特有微生物種類,其中中溫大曲以嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群，其曲房空氣以革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群；高溫大曲在發(fā)酵后期以革蘭氏陽性菌為優(yōu)勢菌群，其曲房空氣以革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群，并且中溫和高溫大曲及各自的曲房空氣微生物在發(fā)酵前期群落組成皆相似[25]。這與本研究結(jié)果基本符合，這表明空氣對大曲微生物群落形成的影響在培菌發(fā)酵前期。此研究結(jié)果對生產(chǎn)功能菌種強(qiáng)化大曲的菌種選擇和添加時間等提供了重要參考?？諝馕⑸镌谧灾鞯叵虼笄羞w移，從而使得在發(fā)酵過程中一些階段的空氣與大曲的微生物類群相似，這是空氣對大曲自然接種的結(jié)果，并且可能會賦予大曲一些特定的微生物類群。張亞麗[26]對茅臺產(chǎn)區(qū)空氣微生物的鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒在釀造過程中有很大一部分特征微生物來自所處的空氣環(huán)境中，并且空氣中的部分微生物存在一定的穩(wěn)態(tài)。

2.4 不同發(fā)酵階段大曲細(xì)菌群落特征與環(huán)境因素的關(guān)系

大曲的生產(chǎn)是自然接種培菌發(fā)酵，其生產(chǎn)環(huán)境對制曲有著重要影響，淀粉、酸度、水分和溫度等環(huán)境因素可能會脅迫性地驅(qū)動大曲發(fā)酵過程的微生物群落演替[27]。本試驗(yàn)利用RDA 分析將兩個酒廠不同階段大曲的OTUs 與環(huán)境因素相結(jié)合，選擇在發(fā)酵過程中豐度較高的22 個菌屬，來探討環(huán)境因素對不同階段大曲細(xì)菌群落的影響。

圖6 理化指標(biāo)與大曲細(xì)菌群落屬水平的RDA 分析Fig.6 The redundancy analysis distribution of bacteria community and physical and chemical indexes in Daqu

如圖6 所示，所選擇的6 個環(huán)境因素共解釋57.41%的物種變化，其中第一和第二排序軸分別貢獻(xiàn)了20.24%和17.96%。紅色箭頭表示經(jīng)Monte Carlo 置換檢驗(yàn)對大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化影響顯著的環(huán)境因素,箭頭長度表征著對細(xì)菌群落的影響程度。各環(huán)境因素對群落結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)性大小依次為淀粉、水分、酸度、濕度、T2 和T1，其中淀粉、水分和酸度是影響大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。從圖中可以看出，T2和T1 和芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬、泛菌屬呈正相關(guān)，與假單胞菌屬、魏斯氏菌屬呈負(fù)相關(guān)；酸度與魏斯氏菌屬、嗜酸菌屬（Acidovorax）呈正相關(guān)；水分和淀粉與黃桿菌屬（Flavobacteria）、乳桿菌屬、短波單胞菌屬（Brevundimonas）呈正相關(guān)。在大曲整個發(fā)酵過程中，多個環(huán)境因素對微生物群落組成協(xié)調(diào)性、交互性等產(chǎn)生驅(qū)動作用，來影響其群落演替。從大曲發(fā)酵不同階段而言，水分與淀粉與大曲發(fā)酵前期呈正相關(guān)，而溫度（T1、T2）與發(fā)酵中后期呈正相關(guān)。環(huán)境因素的變化會推動其群落演替[13]，肖辰以中溫大曲為研究對象，揭示了生物熱是其功能微生物群落形成的關(guān)鍵動力[23]；李小龍揭示了乙醇與酸度協(xié)同作用推動芝麻香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程的微生物群落演替，其對群落演替的協(xié)同解釋率為23.17%[28]；而本研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵階段，推動大曲微生物群落演替的因素不同。發(fā)酵前期，大曲的營養(yǎng)充足，淀粉、水分等營養(yǎng)物質(zhì)對微生物群落組成的影響可能更大，對細(xì)菌群落的演替起到驅(qū)動作用；而在發(fā)酵中后期，由于淀粉、水分等消耗到一定程度，溫度對大曲細(xì)菌群落的影響占主要地位。Wang[29]對三種清香型大曲的微生物群落組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其存在顯著差異，并推斷溫度對清香型大曲的微生物形成具有決定性作用。在中溫和高溫大曲微生物群落形成中溫度也是重要的影響因素，這可能是大曲以品溫區(qū)分的重要原因。

3 結(jié)論

不同品溫大曲的微生物群落差異明顯，本研究以高通量測序技術(shù)對兩種大曲及其曲房空氣微生物群落進(jìn)行比較分析，初步明晰了空氣微生物對大曲的微生物類群影響的變化規(guī)律，并以多元統(tǒng)計(jì)分析方法探究了環(huán)境因素對大曲微生物群落分布的影響。本研究在理論上闡釋了傳統(tǒng)制曲工藝“自然接種”這一工序，這對于制曲生產(chǎn)過程中定向接種功能微生物、調(diào)控環(huán)境參數(shù)以推動發(fā)酵演替都具有重要的指導(dǎo)意義。要進(jìn)一步研究環(huán)境對大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，應(yīng)當(dāng)更加細(xì)化大曲的不同發(fā)酵階段做更深入地研究。因此，深入研究曲房空氣微生物和不同品溫大曲的微生物類群的關(guān)系對大曲生產(chǎn)和研究有重要參考價值。