早期胚胎中干細胞自組織的研究進展*

陳詩樺 焦 陳# 金艷花 金福植

（延邊大學，1 醫(yī)學院，2 再生醫(yī)學研究所，3 附屬醫(yī)院西區(qū)醫(yī)院，延吉 133000）

脊椎動物的發(fā)育在直系同源基因組的調控下，首先創(chuàng)建身體軸—前后軸（anterior-posterior，AP）、背腹軸（dorsal-ventral，DV）和左右軸（left-right，LR）以及胚層—內胚層、中胚層和外胚層，然后逐漸發(fā)育成各種成體形態(tài)。這一系列的發(fā)育過程都體現(xiàn)了動物本身的自組織潛能。自組織（self-organization）是一個系統(tǒng)在自組織機制的作用下，其組織結構不斷自我完善，自動地由無序走向有序，由低級走向高級，從而提高對環(huán)境適應力的過程。組成胚胎的各種固定成分可能被誘導自組織成一個完整的胚胎系統(tǒng)。胚胎發(fā)育的多級調控增加了其穩(wěn)定性，但是這種繁冗的過程使得調控網絡十分復雜，比如信號傳導控制的上皮細胞極化過程。而胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）來源于囊胚植入前的早期胚胎，具有發(fā)育全能性。因此，用胚胎干細胞[1]構建體外干細胞模型進行胚胎學研究，可以脫離上述復雜的調控來揭示胚胎發(fā)育的動態(tài)過程。

1 自組織的基本原理

自組織原理是研究胚胎系統(tǒng)自組織機制的基礎，對幫助了解系統(tǒng)的有序建立及其穩(wěn)定性的維持意義重大。自組織的方式主要包括細胞重排（cell rearrangement）和細胞命運特化（cell fate specialization）。

1.1 細胞重排

在早期胚胎發(fā)育過程中，細胞自組織成黏著性的上皮層，不斷地生長和重排，而不會失去其完整性，從而產生了各種各樣的組織形狀。細胞重排導致原有的對稱性被破壞，如何打破最初的對稱性以引發(fā)不同的細胞命運，最經典的理論是圖靈的反應擴散模型，即緩慢擴散的激動劑和快速擴散的抑制劑周期性變化。激動劑和抑制劑都可以看成一種形態(tài)發(fā)生素，它們擴散形成濃度梯度，梯度實際上就破壞了對稱性，稱為激動劑-抑制劑的形態(tài)發(fā)生模式。該模型的產生基于形態(tài)發(fā)生素的相互作用，在反應擴散模型中，如果一個形態(tài)發(fā)生素在一定程度上誘導自身抑制劑的表達，那么兩個相互作用的形態(tài)發(fā)生素的濃度將因擴散速度不同產生周期性變化。說明細胞重排可能取決于其表達的形態(tài)發(fā)生素在濃度梯度中的位置。

激動劑和抑制劑對原腸胚形成的調節(jié)都可見于小鼠胚胎[2]，基于圖靈模型做一推理：激動劑在一定程度上誘導其自身抑制劑的產生，但抑制劑在組織中的擴散比激動劑更快。結果在某一區(qū)域，激動劑和抑制劑的峰值表達在同一位置，而不是相反位置，在其他區(qū)域，或是激動劑占優(yōu)勢或是抑制劑占優(yōu)勢。因為信號通路通常涉及分泌抑制劑，那么用圖靈模型解釋的細胞重排可能是通過改變激動劑和抑制劑峰值表達的位置，實現(xiàn)對特定信號通路的調控，從而破壞細胞原有的對稱性。

1.2 細胞命運特化

在發(fā)育和整個生命過程中，必須生成各種特化細胞以確保每個組織和器官的正常功能，即細胞發(fā)生命運特化。影響細胞命運特化的因素有許多，如染色質影響細胞重排，并決定細胞命運[3]；細胞外相互作用控制細胞幾何形狀[4]。 除此之外，在細胞間傳導的趨化細胞因子也決定著細胞命運。

細胞間相互作用對維持特定的調節(jié)狀態(tài)至關重要，組成特定組織的細胞表達相同的轉錄調節(jié)狀態(tài)，即細胞命運特化所必需的信號（趨化細胞因子）在細胞間持續(xù)傳導。例如：μcolony模型（μcolony model）中，趨化細胞因子在多能性或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）作用時促進集落內細胞實現(xiàn)共同命運。1988年Gurdon等[5-6]在植物細胞誘導非洲爪蟾動物帽細胞向肌肉細胞轉變的過程中觀察到了共同命運現(xiàn)象，稱為集團效應（community effect）。

2 胚胎早期的自組織現(xiàn)象

受精等一系列過程逐步引發(fā)胚胎細胞進行命運特化，最終形成含有胚胎上胚層、胚外原始內胚層和滋養(yǎng)層等3種細胞類型的囊胚[7-8]。哺乳動物的發(fā)育在囊胚植入前相當保守[9]，但從植入到原腸胚形成，胚胎發(fā)育的調控機制逐漸復雜化，并涉及很多自組織現(xiàn)象。

2.1 胚胎自組織作用

囊胚植入開啟了母體子宮和胚胎之間的信息交流，導致胚胎和母體間發(fā)生組織重組。但比較胚胎學指出，母體子宮和胚胎之間的信息交流不是哺乳動物胚胎早期形態(tài)發(fā)生的必須條件。例如，人類胚胎發(fā)生的關鍵階段是在沒有任何母體組織的情況下進行的[10]；在豬、兔和牛等哺乳動物的胚胎中，胚胎形態(tài)發(fā)生和原腸胚形成（morphogenesis and gastrulation）都在囊胚植入前進行[11-12]。且不同物種哺乳動物的組織間基本關系雖然相對保守，但從小鼠的圓柱形胚胎到人類的二胚層胚盤胚胎，囊胚植入后皆在母體中呈現(xiàn)出了不同的胚胎結構。以上均說明哺乳動物胚胎具有很強的自組織能力，并且可以肯定的是，囊胚植入前的早期胚胎形態(tài)發(fā)生主要依賴于胚胎自組織，植入后再由子宮內環(huán)境幫助完善[13-14]。

2.2 胚胎與胚外組織的相互作用

胚胎和胚外組織之間的相互作用對胚胎結構的塑造至關重要。在小鼠中，極性滋養(yǎng)外胚層細胞在上胚層分泌的成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）的作用下增殖為胚外外胚層[15]，并將繼續(xù)發(fā)育成胎盤；前臟壁內胚層（anterior visceral endoderm，AVE）分泌的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）可以刺激上胚層和外胚層逐漸形成管腔[13，16]，然后融合成羊膜腔[17]。這是構建小鼠身體結構的基礎，也與AVE成為前部信號傳導中心時發(fā)生的對稱性破壞事件相符合—即胚外組織在哺乳動物胚胎中的作用可能不是誘導身體軸的形成，而是誘導早期胚胎的對稱性破壞[18-19]。在人類胚胎中，上胚層形成管腔的方式類似小鼠，其中一個重要區(qū)別是：與滋養(yǎng)層接觸的上胚層形成羊膜上皮，而與下胚層（與AVE等效）接觸的上胚層形成上胚層胚盤[1，9，20]。

3 胚胎相關干細胞的自組織研究

在上述自組織原理基礎上，體外胚胎干細胞模型被提出并不斷完善，更大程度地還原了早期胚胎發(fā)育過程，包括微圖案化培養(yǎng)的胚胎干細胞自組織模型、3D細胞培養(yǎng)的干細胞自組織模型、類原腸胚（gastruloids）模型等。

3.1 微圖案化（micropatterns）培養(yǎng)的胚胎干細胞自組織

基于人類胚盤（embryonic disc）圓盤狀的特性和ESCs能夠分化為上胚層的特性，可以通過微圖案化培養(yǎng)建立胚胎干細胞體外二維模型進行自組織過程的研究。在微圖案化培養(yǎng)過程中，需要限制ESCs生長集落的大小和形狀[21]，并且添加BMP4以提供形態(tài)發(fā)生素（morphogen）引發(fā)物來模擬胚外滋養(yǎng)層環(huán)境。在這個環(huán)境中，ESCs首先以幾何約束的方式逐漸生長發(fā)育為胚外內胚層（extraembryonic endoderm，XEN），模擬的胚外滋養(yǎng)層環(huán)境再繼續(xù)誘導ESCs發(fā)育成細胞分布不同的三胚層胚胎[22]。中、內胚層細胞都表達了相同的標志物Nanog、Brachyury，并受Wnt和Activin/Nodal誘導的BMP4下游信號調控。而外胚層在分泌抑制因子的保護下免受形態(tài)發(fā)生素的影響，相同的分泌抑制因子同時限制原條（primitive streak）空間發(fā)生。因此，在最初的ESCs自組織過程中，一層均勻分布的hESCs可以在大約2 000個細胞的范圍內自構型（self-pattern）而不受胚外組織的影響。不僅如此，微圖案化培養(yǎng)還可以方便探究ESCs自組織過程中影響細胞命運的因素。

細胞距集落邊界的距離與細胞命運息息相關。極化上皮細胞中的信號傳導過程十分復雜，人胚胎干細胞（human ESCs，hESCs）通過頂面—底側極性化[23]（apicobasally polarized），使BMP、Activin、Nodal受體位于基底側，除了集落邊緣的細胞，其他位置的ESCs都不能通過頂端的配體接受信號，從而阻礙中心的細胞一系列信號傳導過程。而細胞分泌的BMP抑制劑Noggin（頭蛋白）又抑制信號向集落邊緣傳導，當BMP抑制信號開始傳導時，信號只能有序地從頂端開始激活。這樣，距集落邊界不同距離的細胞通過激活或抑制不同路徑的信號傳導，使中心細胞和邊緣細胞的發(fā)育走向不同方向[24]。

通過對ESCs頂面—底側極性化發(fā)生的受體分布差異進行空間定位，能夠了解為什么羊膜腔（面朝外胚層頂側）不會短接形成近—遠端形態(tài)（proximal-distal patterning），以及初始BMP反應只在近端發(fā)生卻能誘導、調控遠端側原條衍生物生長發(fā)育的原因[24-25]。通過這樣的ESC體外二維模型能夠方便探究影響小鼠原條衍生物發(fā)育的幾何、化學因素。

3.2 3D細胞培養(yǎng)的干細胞自組織

ESCs和胚外干細胞（extraembryonic stem cells）已被證實在3D細胞培養(yǎng)中可發(fā)生自組織[26-30]。ESCs的3D細胞培養(yǎng)方法較微圖案化培養(yǎng)更貼近真實胚胎發(fā)育情況，還能夠控制ESCs之間在生長時的相互作用力和化學因素對自組織的作用。

利用3D細胞培養(yǎng)進行胚胎干細胞自組織研究，需要將hESCs置于3D軟凝膠培養(yǎng)基上，并在其中摻雜入低濃度的ECM成分[31-32]，這種處理可以誘導細胞團根據原始細胞密度折疊形成封閉的極化殼，即頂?shù)讟O性殼（apicalbasal polarized shell），產生鱗狀、柱狀或不對稱的囊。鱗狀囊是一種具有鱗狀上皮細胞形態(tài)，但不表達干性標志物Nanog、Oct4和Sox2，由BMP信號調控[31]的羊膜樣組織。而柱狀囊將發(fā)育成外胚層，不對稱囊則經歷對稱性破壞事件形成植入后羊膜囊胚[32]（post-implantation amniotic sac embryoid，PASE）。這種由hESCs自組織形成的不對稱囊胚，類似于人羊膜囊植入后的階段，其特征是中央羊膜腔被連續(xù)的上皮細胞包圍，在BMP的作用下，通過Wnt信號調控，極化并破壞對稱性[33]，從而形成原始外胚層和后部原條（posterior primitive streak）。

根據這些結構的形成過程，推測由此產生的羊膜囊的形態(tài)發(fā)生可能依賴于Snai1調控[32]的上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并且需要BMP在假定的上胚層誘導Brachyury 表達，但其中的對稱性破壞機制仍然未知。該ESC體外3D模型對人類植入后羊膜囊發(fā)育的多個事件進行模擬，從而進一步理解胚胎形態(tài)發(fā)生的調控和細胞命運特化。由于能夠在3D培養(yǎng)凝膠表面定位，未來的研究將可以闡明形態(tài)學如何影響細胞間信號傳導。

3.3 基于擬胚體（embryoid bodies，EB）的干細胞自組織

EB是由ESCs在體外通過分化而形成的三胚層結構。在體內，細胞的分化依賴于信號轉導和形態(tài)發(fā)生素梯度分布；在體外EB模型中，這一特點體現(xiàn)于原條的形成，主要與Wnt信號通路的局部激活有關[34]。在Wnt信號通路介導的激活域，ESCs經歷了EMT，并分化為中胚層祖細胞，在外源性Wnt3a蛋白作用下，繼續(xù)分化成中胚層。這樣的EB體外分化模型為激發(fā)干細胞的自組織潛能提供了另一種方法：一組mESCs經Wnt激動劑處理后，會經歷對稱性破壞，自組織成一個表達身體軸—AP、DV和LR軸[35]的管樣組織，被稱為類原腸胚，與體內早期胚胎明顯相似。

基于EB的ESCs自組織模型，即類原腸胚的形成過程與時間順序和胚外組織中信號的空間分布[36]緊密聯(lián)系，由Wnt /β-catenin與Nodal信號轉導精確控制，在恰當?shù)臅r間順序和嵌套的伸縮域重現(xiàn)了原腸胚形成時胚胎基因表達的“時空”模式，比如39個HOX基因[37]按順序地激活，以調控胚胎枕后區(qū)域的形成。這樣的胚胎干細胞體外模型模仿體內早期胚胎真實的基因“時空”表達模式，并且體現(xiàn)身體軸基因調控系統(tǒng)的特征，展示了類原腸胚模型研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育調控過程的優(yōu)越性。

3.4 胚外干細胞的自組織

ESC模型揭示了同類細胞群如何通過自組織過程產生不同的細胞命運。然而，這些模型無法最真實地模擬體內胚胎發(fā)育，其不足之處在于它們缺乏胚外組織，而胚外組織對胚胎發(fā)育至關重要，并為信號傳導的相互作用提供了空間環(huán)境。不同類型的干細胞之間不僅能相互傳遞信號，而且每個干細胞都是胚胎空間形態(tài)發(fā)生的基礎，因此，在胚胎干細胞與胚外干細胞相互作用的前提條件下，經過自組織過程很可能會形成類原腸胚結構，誕生了新的干細胞胚胎模型[38-40]。

將mESCs與滋養(yǎng)細胞干細胞（trophoblast stem cells，TSCs）結合在ECM中進行培養(yǎng)[38]，形成了一個形態(tài)發(fā)生與天然胚胎明顯相似的植入后胚胎樣結構。在該模型中，細胞在Nodal信號[38]的調控下，開始自組織，發(fā)生極化，并在ESCs衍生的胚胎和TSCs衍生的胚外區(qū)室中形成管腔，然后相互融合。這樣的胚胎模型被稱為“ETS胚胎[38]”。ETS胚胎形成過程中，響應Wnt和BMP信號，于ESCs和TSCs的交界處出現(xiàn)中胚層和原始生殖細胞標志物及Brachyury不對稱表達域。較之僅使用ESCs來源的結構（如擬胚體），ETS胚胎能更貼近地模擬體內早期胚胎結構的形成和基因表達的“時空”模式。

這樣的極化胚胎樣結構仍具有局限性，雖然能誘導中胚層形成，但不繼續(xù)形成原腸胚。用第3種類型的干細胞—胚外內胚層干細胞（extraembryonic endoderm stem cells）代替ECM進行培養(yǎng)后，所形成的結構在形態(tài)學、基因表達和信號傳導等方面與植入后早期胚胎更為相似。這樣的結構在活躍的BMP和Wnt信號調控下自組織形成的臟壁內胚層（visceral endoderm，VE）成為一個信號中心，在腔隙融合的過程中通過促進對Nodal和Wnt信號傳導的抑制作用控制AP軸發(fā)生和EMT，破壞胚胎和胚外邊界，從而形成中胚層和定形內胚層（definitive endoderm）[40]。最后，可以觀察到依據胚胎發(fā)育時空特征表達出的原始生殖細胞標記物。在這個過程中，ESCs遷移形成的中胚層，夾在外胚層和XEN衍生的AVE之間，而定形內胚層會取代XEN成為早期到中期原腸胚形成的標志，這指出了來自胚胎和2個胚外組織的細胞的正確編排是形成正常胚胎形態(tài)的根本條件。這樣的胚胎樣結構植入小鼠母體后會誘導蛻膜反應（decidua reaction），但不會進一步發(fā)育。

干細胞模型具有很大的植入后發(fā)育潛能，將mESCs與TSCs在非貼壁條件下共同培養(yǎng)，可產生在形狀、基因表達和細胞間通訊方面與囊胚明顯相似的植入前胚胎樣結構。其形態(tài)在更接近真實胚胎的胚外干細胞衍生物環(huán)境下能夠更加完善。同樣，最新發(fā)現(xiàn)的新型多能干細胞系EPS細胞，能夠形成胚胎和胚外組織，并為基礎和轉化研究開辟了新的途徑[41]。

4 總結與展望

胚胎發(fā)生相關的干細胞模型可以通過調控胚胎發(fā)育的幾何形狀、生長環(huán)境及改變實驗方法來探究胚胎和胚外組織相互作用，以解析經典的胚胎發(fā)育過程。例如原腸胚形成是在形態(tài)不規(guī)則的胚胎樣結構中進行的，但目前還存在許多問題尚未解決：模型構建初始是否需要調節(jié)該胚胎樣結構形態(tài)以還原相同體內生長環(huán)境；原條發(fā)生具體受哪些物理、化學信號調控；在沒有AVE的情況下能夠在多大程度上誘導原腸胚形成等。

胚胎無法植入是早期妊娠流產的主要原因，但是人類胚胎中此階段發(fā)生的細胞和分子變化仍然未知。為達研究目的，利用人類囊胚和子宮內膜細胞的共培養(yǎng)模擬植入后形態(tài)發(fā)生的母體環(huán)境。然而，這些模型在多大程度上還原了人類胚胎植入后的發(fā)展，仍然是一個懸而未決的問題。因此，干細胞自組織模型能更好地闡述由形態(tài)和時間控制的遺傳決定因素如何調控早期胚胎發(fā)育。

構建干細胞自組織模型時，胚胎干細胞團的每個成員都開始特化，并自組織成為胚胎，就像在體外從純化的組分中重建生化系統(tǒng)一樣，體現(xiàn)了從局部中理解整體的重要性。例如，“將hESC與人類TSC以及潛在的人類下胚層干細胞結合，可以重現(xiàn)人類母體妊娠過程”。但是由干細胞衍生而來的胚胎只是研究生物體發(fā)育的實驗模型，因此它們不能完全重現(xiàn)生物體發(fā)育過程中的所有復雜性。這是胚胎干細胞模型的局限性，也是未來研究需要解決的問題之一。干細胞胚胎學領域正處于起步階段，未來實驗研究將通過優(yōu)化調整相關化學和物理參數(shù)以及選用具有更大發(fā)育潛能的干細胞系來促進干細胞自組織模型的發(fā)展并擴展其應用前景。