肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

于盼，朱麗華*，闕祖俊，田建輝,

0 引言

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。2017年死于肺癌的總?cè)藬?shù)超過(guò)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和腦瘤的總和，預(yù)計(jì)2020年死于肺癌的人數(shù)將達(dá)到所有癌癥死亡人數(shù)的22%以上[1]，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌高病死率的主要原因。腫瘤的異質(zhì)性是單次活檢無(wú)法獲取腫瘤全部分子信息的重要原因，也是造成腫瘤耐藥性的基礎(chǔ)，因此需要對(duì)腫瘤的分子分型進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。液體活檢作為一種非侵入性的腫瘤檢測(cè)方法，可持續(xù)、動(dòng)態(tài)地評(píng)估腫瘤細(xì)胞的基因突變狀態(tài)[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）、外泌體、mi-RNA、cf-DNA等是肺癌液態(tài)活檢的主要檢測(cè)指標(biāo)[4]，其中CTCs可以提供包含DNA、RNA和蛋白質(zhì)等多層次的分子信息，而其他指標(biāo)只能提供遺傳層面的異常信息[5]?？梢?jiàn)CTCs在肺癌的診斷、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后預(yù)測(cè)等方面作用顯著[6]。本文討論了CTCs的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過(guò)程、檢測(cè)方法，以及肺癌CTCs在臨床早期篩查、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、療效監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用，并融合入中醫(yī)“正虛伏毒”理論，以期為肺癌轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化研究提供新的思路。

1 肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞

1869年，Ashworth首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念，CTCs是從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血液的腫瘤細(xì)胞，從浸潤(rùn)至進(jìn)入循環(huán)會(huì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過(guò)程進(jìn)而造成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和定植[7]。2019年，田建輝等從一例Ⅱa期肺癌患者的血液中分離出CTCs，成功建立了永久性的人肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系CTCTJH-01。CTC-TJH-01處于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的中間階段，具有干細(xì)胞表型、耐藥性強(qiáng)和休眠的特性，在NOD-SCID小鼠上具有致瘤性和肺轉(zhuǎn)移能力[8]。根據(jù)EMT的不同階段可將CTCs亞群分為上皮-間充質(zhì)型循環(huán)腫瘤細(xì)胞、上皮型循環(huán)腫瘤細(xì)胞和間充質(zhì)型循環(huán)腫瘤細(xì)胞[9]，不同表型的CTCs轉(zhuǎn)移能力有所差異。

2 CTCs參與腫瘤轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過(guò)程

2.1 腫瘤細(xì)胞脫落

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落浸潤(rùn)基底膜主要有兩種方式：（1）EMT介導(dǎo)途徑。EMT是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過(guò)程，通過(guò)分泌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Snail、Twist、ZEB-1）、細(xì)胞外分子（TGF-β、HGF）、炎性細(xì)胞以及特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Wnt、β-catenin、NF-κB、PI3K）調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（上皮標(biāo)志物：EpCAM、E-cadherin、CK；間質(zhì)標(biāo)志物：Vimentin、N-cadherin等）表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞向間充質(zhì)型轉(zhuǎn)化，從而獲得更強(qiáng)的移動(dòng)性并抵抗細(xì)胞凋亡[10]；（2）非EMT介導(dǎo)途徑。腫瘤細(xì)胞通過(guò)外力和中心體增大的方式，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞被動(dòng)滲入血液，以單細(xì)胞或細(xì)胞簇的形式離開(kāi)原發(fā)腫瘤[11]。通過(guò)以上兩種方式進(jìn)入循環(huán)的CTCs可能具有不同的細(xì)胞表型，皆可引起腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.2 血液循環(huán)中的CTCs

實(shí)體腫瘤每天都有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，CTCs在血液循環(huán)中面臨著免疫監(jiān)視、血流剪切力、氧化應(yīng)激等多方面的因素，只有未被免疫系統(tǒng)清除的CTCs才能進(jìn)一步播散定植[12]。其中單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞易被免疫細(xì)胞清除，發(fā)生失巢凋亡。而由多個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞組成的循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇或循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor microemboli,CTM）能更大程度上發(fā)生免疫逃逸，具有更強(qiáng)的凋亡抵抗，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。血液循環(huán)中的CTCs可被血小板識(shí)別，激活血小板并誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子釋放和聚集，形成由血小板包被的細(xì)胞簇，從而逃避NK細(xì)胞和T細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而發(fā)生免疫逃逸[14]。

2.3 CTCs遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和定植

進(jìn)入血液循環(huán)的CTCs可以錨定在內(nèi)皮細(xì)胞的表面，通過(guò)受體-配體結(jié)合的方式使CTC發(fā)生外滲，進(jìn)而產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。不同的是，單個(gè)CTCs通過(guò)毛細(xì)血管向外遷移，而CTC簇可逆性地重組為單排鏈，再橫向穿過(guò)毛細(xì)血管[15]。CTCs表面的整聯(lián)蛋白通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子1（ICAM1）或血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM1）結(jié)合，為CTCs突破血管壁細(xì)胞外基質(zhì)提供動(dòng)力。CTCs產(chǎn)生的趨化因子配體取決于各自受體的表達(dá)，進(jìn)而決定遠(yuǎn)處的歸巢器官[16]。CTCs還可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中相關(guān)抑制性免疫細(xì)胞以支持自身增殖和存活。

3 肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)

CTCs的富集和分離主要有兩種方式：其一，基于CTCs獨(dú)特的物理特性，通過(guò)過(guò)濾或密度梯度離心等方式獲取，被稱為“非標(biāo)記依賴法”；其二，基于CTCs經(jīng)歷的EMT過(guò)程，表達(dá)特異性細(xì)胞表面蛋白，可通過(guò)免疫磁珠分選、抗體特異性結(jié)合等方式獲得，被稱為“標(biāo)記依賴法”，最常用的細(xì)胞表面標(biāo)志物是上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）、細(xì)胞角蛋白（CK）等。目前常用的基于物理方法的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)主要有：ISET、MetaCell、CellSieve、Parsortix、OncoQuick、Vita-Assay等；基于標(biāo)記依賴的CTCs檢測(cè)儀器主要有：CellSearch、MagSweeper、MACS、EPISPOT、CellCollector等[17]。然而，不同系統(tǒng)的CTCs檢出效率有差異，如Tamminga等比較了CellSearch和ISET對(duì)肺癌CTCs的檢出率，發(fā)現(xiàn)CellSearch的檢出率為69%，而ISET的檢出率為88%，表明ISET更適合于肺癌患者的CTCs檢測(cè)[18]。

研究者正在對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化研究，研發(fā)出多種不同原理的CTCs檢測(cè)方法和新型檢測(cè)儀器，以提高肺癌CTCs的檢出率：（1）微流控裝置。Wang等設(shè)計(jì)的集成微流控裝置對(duì)肺癌CTCs的平均回收率達(dá)到92.5%，純度達(dá)到94%[19]；（2）芯片法。Yan等則使用集成多功能電化學(xué)芯片將CTCs的捕獲效率控制在8%～100%[20]；（3）免疫磁珠分離法。通常采用上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）作為主要標(biāo)志物，將與磁性微粒結(jié)合的EpCAM抗體加入外周血中，通過(guò)免疫磁珠分離富集CTCs[21]；（4）納米技術(shù)。核酸適配體修飾的PEG-PLGA-納米纖維（PPN）微流控系統(tǒng)，可識(shí)別肺癌患者中罕見(jiàn)的CTC亞型并進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高對(duì)多克隆源性腫瘤細(xì)胞的捕獲效率[22]；（5）新型肺癌CTCs檢測(cè)儀器。光流式細(xì)胞儀（OFCM）集成了多級(jí)微流控芯片和四色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，可以完成自動(dòng)肺癌CTCs分離，進(jìn)行3D聚焦和單細(xì)胞表型分析[23]。

4 肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床應(yīng)用

4.1 早期篩查

肺癌患者在癌癥發(fā)展早期基本處于無(wú)癥狀階段，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已至中晚期，已發(fā)生轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失治療的最佳時(shí)機(jī)。肺癌的早期篩查主要通過(guò)低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描（LDCT）實(shí)現(xiàn)，然而LDCT具有高假陽(yáng)性，令患有非惡性結(jié)節(jié)的患者面臨不必要的活檢相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)[24]。Duan等使用Cell-Collector檢測(cè)了44名肺結(jié)節(jié)患者和20例健康志愿者外周血中的CTCs，在志愿者外周血中未檢測(cè)到CTCs。通過(guò)病理學(xué)診斷結(jié)果對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)節(jié)患者外周血中CTCs陽(yáng)性率為52.94%，其診斷特異性為90%，CellCollector系統(tǒng)檢測(cè)CTCs可有效區(qū)分良惡性結(jié)節(jié)，用于肺癌早期篩查[25]。Li等采用陰性富集-熒光原位雜交（NE-FISH）方法檢測(cè)肺癌患者及健康志愿者外周血中CTCs水平，發(fā)現(xiàn)肺癌患者的CTCs數(shù)量明顯高于志愿者或患有良性肺疾病的患者，將CTCs與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可提高早期肺癌患者的診斷敏感度[26]。

4.2 預(yù)后及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)

肺癌的預(yù)后與分期密切相關(guān)。大量研究表明，檢測(cè)肺癌患者手術(shù)、放化療前后血液中的CTCs數(shù)量和亞群可預(yù)測(cè)預(yù)后，指導(dǎo)進(jìn)一步的治療。Wang等發(fā)現(xiàn)放射治療后NSCLC患者外周血中PD-L1+CTC亞群比例升高，預(yù)示著治療反應(yīng)與預(yù)后不良[27]。Tamminga等研究發(fā)現(xiàn)晚期NSCLC患者體內(nèi)CTCs的存在與酪氨酸激酶抑制劑（TKI）或化療反應(yīng)率低、無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）短相關(guān)[28]。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡、生存期短和生活質(zhì)量低的主要原因?；颊咝g(shù)后伴有原發(fā)灶切除和淋巴結(jié)清掃，短期內(nèi)無(wú)法評(píng)估和發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況。有研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)可以導(dǎo)致肺癌患者術(shù)后CTCs數(shù)目減少，但術(shù)后1天與3天的CTCs數(shù)目出現(xiàn)早期反彈現(xiàn)象，且與幾月后的復(fù)發(fā)有關(guān)[29]。Chinniah等對(duì)48例接受放化療的局部晚期非小細(xì)胞肺癌（LA-NSCLC）患者的CTCs進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在患者外周血中檢測(cè)到CTCs早于放射影像學(xué)證據(jù)顯示疾病復(fù)發(fā)[30]。

4.3 化療及免疫靶向治療的療效監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)

由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，存在基因突變（如ALK重排、EGFR突變等）的患者易發(fā)生耐藥突變，此時(shí)需要進(jìn)行重復(fù)的基因檢測(cè)。通過(guò)對(duì)捕獲的CTCs進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序可以檢測(cè)到EGFR、MET、ALK和ROS1等基因的分子變化以及PD-L1的表達(dá)，鑒定肺癌患者免疫靶向治療后的耐藥性突變，其動(dòng)態(tài)變化有助于實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)及個(gè)性化治療方案的選擇[31]。Guibert等研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外周血中分離的CTCs表面PD-L1陽(yáng)性率（83%）高于癌組織（41%），且在使用PD-L1抑制劑治療的患者中，治療前PD-L1+CTCs與預(yù)后不良相關(guān)[32]。

5 創(chuàng)新肺癌亞臨床研究思路，提出并驗(yàn)證“正虛伏毒”學(xué)說(shuō)

早期肺癌術(shù)后患者影像學(xué)評(píng)估無(wú)可見(jiàn)病灶，臨床評(píng)估為治愈，但是其外周循環(huán)和器官組織中還存有CTCs或休眠的腫瘤細(xì)胞，患者實(shí)際上處于肺癌轉(zhuǎn)移的亞臨床狀態(tài)，這將成為日后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生的根源。針對(duì)該階段病理特征，田建輝傳承《道德經(jīng)》“有生于無(wú)”和《黃帝內(nèi)經(jīng)》重視“正氣”思想，融合現(xiàn)代腫瘤學(xué)和免疫學(xué)進(jìn)展，提出“正虛伏毒”學(xué)說(shuō)并系統(tǒng)驗(yàn)證，“正虛”主要免疫衰老和免疫逃逸為主的免疫抑制內(nèi)環(huán)境，“伏毒”指高危人群或術(shù)后患者體內(nèi)存在的腫瘤干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和休眠腫瘤細(xì)胞等，“伏毒”具有“毒自內(nèi)生，深伏血道，內(nèi)藏臟腑，流注全身，伺機(jī)為患，正盛則伏而不出，正虛則出而為病”的特點(diǎn)。認(rèn)為肺癌術(shù)后患者存在伏毒是絕對(duì)事件，而最終是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫功能紊亂可以表現(xiàn)為免疫監(jiān)視和免疫清除能力下降（正虛），促使?jié)摲诨颊哐h(huán)系統(tǒng)或者臟器內(nèi)的CTCs（伏毒）、休眠腫瘤細(xì)胞和微小轉(zhuǎn)移灶等發(fā)生免疫逃逸，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的發(fā)生[33]。該學(xué)說(shuō)為肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究提供了啟發(fā)和探索。

課題組前期采用陰性富集和陽(yáng)性富集（微流控芯片結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)）研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中CTC計(jì)數(shù)與臨床分期之間存在負(fù)相關(guān)性，早期患者外周血中具有較高數(shù)目的CTCs。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞Tregs和MDSCs的比例與肺癌患者的臨床分期呈正相關(guān)[34]。提示在局部臟器中免疫抑制微環(huán)境的形成可能是促進(jìn)CTCs定植后存活、增殖形成轉(zhuǎn)移灶的原因之一，目前正在進(jìn)一步研究。此外，田建輝課題組圍繞前期建立的肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞系（CTC-TJH-01），證實(shí)其具有干細(xì)胞表型、休眠、免疫逃逸特征，體內(nèi)研究證實(shí)其致瘤性和肺轉(zhuǎn)移特征，目前發(fā)現(xiàn)CTCs形成細(xì)胞簇后較單個(gè)CTCs具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力；而調(diào)控NK細(xì)胞功能可抑制CTCs肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生等現(xiàn)象，從而構(gòu)建了肺癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外研究平臺(tái)，促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化研究效率的提高[35]。

6 小結(jié)與展望

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致早期肺癌術(shù)后患者死亡的主要因素，也是制約肺癌整體防控效率提高的關(guān)鍵，但是目前仍缺乏成熟的亞臨床階段發(fā)病學(xué)理論，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究豐富了對(duì)該階段的認(rèn)識(shí)。2018版CSCO《原發(fā)性肺癌診療指南》肯定了肺癌術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)中的價(jià)值，并逐漸進(jìn)入臨床研究。然而現(xiàn)階段肺癌CTCs的研究仍局限于檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與完善，由于CTCs檢測(cè)技術(shù)具有多樣性，而應(yīng)用不同原理研發(fā)的檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度存在差異，導(dǎo)致臨床上尚缺乏統(tǒng)一的檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)；另外由于不同CTCs亞群的轉(zhuǎn)移能力也有所區(qū)別，僅以CTCs數(shù)目預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移仍存在爭(zhēng)議；CTCs最終是否轉(zhuǎn)移與其所處環(huán)境因素密切相關(guān)，如CTCs與自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞；T、B淋巴細(xì)胞等適應(yīng)性免疫細(xì)胞以及血小板等存在復(fù)雜的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究探索[36]。因此，通過(guò)精準(zhǔn)鑒定轉(zhuǎn)移潛能強(qiáng)的CTCs亞群，進(jìn)而與免疫、凝血功能狀態(tài)結(jié)合構(gòu)建肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)模型是促進(jìn)臨床推廣的關(guān)鍵。充分發(fā)揮中醫(yī)學(xué)認(rèn)知疾病的系統(tǒng)性優(yōu)勢(shì)，融合現(xiàn)代科學(xué)精華不斷創(chuàng)新肺癌轉(zhuǎn)移理論和研究體系，將促進(jìn)突破制約轉(zhuǎn)移療效提高的瓶頸，推動(dòng)肺癌整體防控效率的提高。